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37478
Protein G Agarose Beads
WB & IP 试剂

Protein G Agarose Beads #37478

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筛选器:
  1. IP

使用 COX IV (4D11-B3-E8) Mouse mAb #11967 和 Protein G Agarose Beads 对 HeLa 细胞的 COX IV 进行免疫沉淀 (IP)。使用 COX IV (3E11) Rabbit mAb #4850 对免疫沉淀物(泳道 1)和上清液(泳道 2)进行蛋白质印迹分析。

使用 Akt (pan) (40D4) Mouse mAb #2920 和 Protein G Agarose Beads 对 3T3 细胞的 Akt 进行免疫沉淀 (IP)。使用 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691 对免疫沉淀物(泳道 1)和上清液(泳道 2)进行蛋白质印迹分析。

产品使用信息

涡旋试管片刻,以重悬微珠。每次免疫沉淀 (IP) 反应添加 20-40 μl 珠浆。对于微珠洗涤和之后的免疫复合体洗脱,使用微量离心机以 6,000 rpm 的转速短暂地离心分离 1 分钟,可从溶液中分离出微珠。通过轻轻涡旋或摇晃试管在溶液中重悬微珠。请遵循 CST 建议的免疫沉淀实验步骤来进行免疫沉淀,随后进行蛋白质印迹实验。

存储:

以 50% 混悬液溶于 20% 的乙醇中保存。储存在 4°C。本产品可稳定保存 12 个月。

实验步骤

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天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein G agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以便之后进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein G Agarose Beads:(#37478)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶测定):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,需将 100 μl 10X 激酶缓冲液添加到 900 μl dH2O 中,然后进行混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶测定):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 μM),需将10 μl ATP (10 mM) 添加到 490 μl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 将 10–30 μl 的 50% Protein G agarose bead 混悬液添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀

  1. 将一抗(按产品数据表中的建议进行适当稀释)添加到 200 μl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 Protein G agarose(10–30 μl 的 50% 混悬液)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 在 SDS-PAGE 的 4–20% 的凝胶上加载样品 (15–30 μl)。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 使沉淀物悬浮在添加 40 μM ATP 和适当底物的 200μl 1X 激酶缓冲液中。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 在 SDS-PAGE (4–20%) 上加载样品 (15–30 μl)。

发布​于 2016 年 10 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号:1244

产品说明

Protein G Agarose Beads 是一种在免疫沉淀(免疫沉淀检测)中小规模地分离免疫复合体的亲和基质。蛋白 G 能共价结合琼脂糖珠。蛋白 G 对许多物种(包括人、兔、小鼠、大鼠和羊)的 IgG 亚类都有高亲和力,并且能与这些抗体一起进行免疫沉淀检测。

产品规格:

微珠直径:每个微珠约 50-150 微米

结合能力:约 20 mg 人 IgG/ml

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

购买 # 37478S
产品货号 规格 价格 库存
37478P
200 µl(10 次免疫沉淀)
37478S
1 ml(50 次免疫沉淀)

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