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8050
Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)

Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) #8050

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
M Dm 所有物种 内源性 兔 IgG
IP

使用 Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate)(泳道 1 和 2)和 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Magnetic Bead Conjugate) #8726(泳道 3 和 4),对未经处理或已经 Calyculin A 处理的 Jurkat 细胞裂解物进行免疫沉淀。使用 Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (HRP Conjugate) #6950 检测蛋白质印迹。

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 6-Tube Magnetic Separation Rack:(#7017)。
  3. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  4. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加 10 µl 固定化抗体,在 4°C 转动孵育过夜
  2. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 4 次,共计洗涤 5 次。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 使用磁力架洗涤沉淀物并将微珠沉淀,待完全澄清后,废弃上清液,添加 500 µl 1X 激酶缓冲液,涡旋混合以重悬及洗涤微珠,继续重复 1 次,共计洗涤 2 次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2007 年 12 月 

实验步骤编号:408

应用 稀释度
免疫沉淀 1:20
存储:

保存在 PBS 缓冲液(pH 为 7.2),0.1% Tween® 20 中。储存在 4°C。切勿分装抗体。

Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) 可识别包含磷酸化 Ser/Thr(其前方的 3 位点有 Arg)的肽和蛋白。观察到它可在某种程度上优先检测包含磷酸化 Ser/Thr(在其前方的位点 -5 和 -3 有 Arg)的肽。(美国专利号:6,441,140;6,982,318;7,259,022;7,344,714;美国系列号 11,484,485;和全部外国同类产品)

物种反应性:

小鼠,黑腹果蝇 ,预期的所有物种

使用磷酸-Akt 底物合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体通过甲酰苯甲酰胺修饰抗体与酰肼激活磁珠之间的共价反应进行固定。

Phospho-Akt Substrate (RXXS*/T*) (110B7E) Rabbit mAb (Magnetic Bead Conjugate) 可用于对磷酸化 Akt 底物蛋白进行免疫沉淀。

作为激酶的一个重要类别,Arg 引导型激酶或 AGC 家族激酶,包括 cAMP-依赖性蛋白激酶 (PKA)、cGMP-依赖性蛋白激酶 (PKG)、蛋白激酶 C、Akt 和 RSK。这些激酶具有相同的底物特异性,其特征为相对于磷酸化的 Ser 或 Thr 位点,具有在位置 -3 处 的 Arg (1,2)。Akt 在介导关键细胞反应(包括细胞生长与存活、血管生成和转录调节)中发挥核心作用 (3-5)。尽管已经知道多种 Akt 底物(如 GSK-3、Bad 和胱天蛋白酶-9)但是许多重要的底物仍等待发现。Akt 仅在以位置 -5 和 -3处 Arg 为特征的保守基序中在 Ser/Thr 位点磷酸化底物 (6)。Cell Signaling Technology 的磷酰-Akt 底物特异性抗体是研究 Akt 和其他 Arg 引导型激酶调节磷酸化以及高通量激酶药物研发的强有力工具。

  1. Montminy, M. (1997) Annu Rev Biochem 66, 807-22.
  2. Pearson, R.B. and Kemp, B.E. (1991) Methods Enzymol 200, 62-81.
  3. Marte, B.M. and Downward, J. (1997) Trends Biochem Sci 22, 355-8.
  4. Jiang, B.H. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97, 1749-53.
  5. Scheid, M.P. and Woodgett, J.R. (2000) Curr Biol 10, R191-4.
  6. Alessi, D.R. et al. (1996) FEBS Lett 399, 333-8.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
在某些方法中,使用 Cell Signaling Technology (CST) 基序抗体(例如,美国专利号 7,198,896 和 7,300,753)可能要求获得 CST 的许可证。关于学术许可条款信息,请您的技术转移办公室按照 CST_ip@cellsignal.com 联系 CST 法律部门。关于商业许可条款信息,请按照 ptmscan@cellsignal.com 联系 CST Pharma 服务部门。

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400 µl (40 次免疫沉淀)

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