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6707
AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
WB & IP 试剂

AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) #6707

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk 内源性 62 兔 IgG
IP

使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) #3423 和 AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 对 293 和 C6 细胞裂解物进行免疫沉淀。使用 AMPKα (F6) Mouse mAb #2793 检测蛋白质印迹。

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  3. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取出​200 μl 细胞裂解液,然后添加10 μl 的 固定抗体,并在4°C旋转孵育过夜
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2007 年 12 月 

实验步骤编号:27

应用 稀释度
免疫沉淀 1:20
存储:

存储在 10 mM HEPES 钠 (pH 为 7.5 ),150 mM NaCl、100 µg/ml BSA,50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可检测内源水平的 AMPKα 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

使用与人 AMPKα 的氨基末端序列相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体通过其伯胺基团,与经N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 激活的 Sepharose® 糖珠共价结合AMPKα (23A3) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可用于进行免疫沉淀检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联 AMPKα (23A3) Rabbit mAb #2603 相同。

AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物中都高度保守,且在调节能量平衡方面发挥关键作用 (1)。AMPK 蛋白以一种异三聚体复合体的形式存在,由一个 α-催化亚基、一个 β-调节亚基和一个 γ-调节亚基组成,每个亚基被两到三个不同基因编码 (α1、2;β1、2;γ1、2、3) (2)。该激酶会被因细胞和环境压力引起AMP/ ATP 比值升高而激活,如热休克,缺氧和缺血 (1)。抑癌基因 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 一同将位于活化环里 Thr172 位点的 AMPKα 磷酸化,该位点的磷酸化是 AMPK 激酶活性所必需的 (3-5)。AMPKα 在 Thr258 位点和 Ser485 位点(对于 α1;α2 是 Ser491 位点)也被磷酸化。上游激酶以及这些磷酸化事件的生物学意义尚未被阐明 (6)。β1 亚基是通过豆蔻酰化和多位点磷酸化翻译后修饰的,这些位点包括 Ser24/25 位点、Ser96 位点、Ser101 位点、Ser108 位点和 Ser182 位点 (6,7)。β1 亚基 Ser108 位点的磷酸化似乎对 AMPK 酶活性是必要的,而 Ser24/25 位点和 Ser182 位点的磷酸化会影响 AMPK 定位 (7)。已确定了一些 AMPKγ 亚基的突变,其中大部分位于假定的 AMP/ ATP 结合位点(CBS 或Bateman域)。这些位点的突变导致 AMPK 活性降低,引起心脏或骨骼肌糖原积累 (1,2)。越来越多证据表明,AMPK 不仅调节脂肪酸和糖原的代谢,也通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路调节蛋白质合成和细胞生长,另外还通过 eNOS / nNOS 调节血流量 (1)。

  1. Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 3329-35.
  6. Woods, A. et al. (2003) J Biol Chem 278, 28434-42.
  7. Warden, S.M. et al. (2001) Biochem J 354, 275-83.
Entrez-Gene Id
5562 , 5563
Swiss-Prot Acc.
Q13131 , P54646
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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