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5939
AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)
WB & IP 试剂

AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) #5939

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk 内源性 67 兔 IgG
IP

使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Sepharose® Bead Conjugate) #3423 和 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate), 对 Jurkat、NIH/3T3 和 HeLa 细胞的提取物进行免疫沉淀。使用 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 和 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127 检测蛋白质印迹。

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用于蛋白免疫印迹分析的免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法,进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808)。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 mM EGTA,1% Triton X-100,2.5 mM 焦磷酸钠,1 mM β 甘油磷酸酯,1 mM Na3VO4,1 μg/ml 亮抑酶肽

    注意: CST 建议在使用前应添加 1 mM PMSF (#8553)*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝
  2. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  3. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 在 4°C,14,000 x g 条件下,离心 10 分钟,将上清转移到新管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取出​200 μl 细胞裂解液,然后添加10 μl 的 固定抗体,并在4°C旋转孵育过夜
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  3. 继续使用蛋白质印迹法或激酶活性分析对进行样品分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:为了最大限度减少变性 IgG 重链产生的遮盖作用 (~50 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa),我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​于 2007 年 12 月 

实验步骤编号:27

应用 稀释度
免疫沉淀 1:20
存储:

存储在 10 mM HEPES 钠 (pH 为 7.5 ),150 mM NaCl、100 µg/ml BSA,50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可识别内源水平的 AIF 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

牛 , 犬

使用与人 AIF 蛋白中 Ala520 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体通过其伯胺基团,与经N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) 激活的 Sepharose® 糖珠共价结合AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate) 可用于对 AIF 进行免疫沉淀。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 相同。

凋亡诱导因子 (AIF, PDCD8) 是一种普遍表达的黄素蛋白,在 caspase 非依赖型凋亡过程中发挥关键作用(在1,2中论述)。AIF 通常定位于线粒体的内膜间隙,并在凋亡刺激后释放 (3)。用重组 AIF 处理分离的胞核会导致早期凋亡现象,如染色质凝聚和大规模的 DNA 片段化 (3)。针对 AIF 敲除小鼠的研究表明,AIF 的凋亡活性依赖于细胞类型和刺激。另据报道,AIF 为胚体空腔化所需,相当于胚胎形态发生过程中程序性细胞死亡的第一波 (4)。AIF 的结构分析揭示了两个重要的区域,一个具有氧化还原酶活性,另一个是潜在的 DNA 结合域 (3,5)。AIF 有氧化还原活性,可以表现为 NADH 氧化酶,但在诱导细胞凋亡过程中并不需要这种活性 (6)。然而,最近的研究表明,AIF 具有双重功能,即通过在细胞核中结合 DNA 发挥促凋亡活性,以及通过其氧化还原酶活性清除自由基发挥抗凋亡活性 (2,7)。

  1. Daugas, E. et al. (2000) FEBS Lett 476, 118-23.
  2. Lipton, S.A. and Bossy-Wetzel, E. (2002) Cell 111, 147-50.
  3. Susin, S.A. et al. (1999) Nature 397, 441-6.
  4. Joza, N. et al. (2001) Nature 410, 549-54.
  5. Ye, H. et al. (2002) Nat Struct Biol 9, 680-4.
  6. Miramar, M.D. et al. (2001) J Biol Chem 276, 16391-8.
  7. Klein, J.A. et al. (2002) Nature 419, 367-74.
Entrez-Gene Id
9131
Swiss-Prot Acc.
O95831
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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