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3678
Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb
二抗

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678

Citations (28)
筛选器:
  1. WB

使用 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb(小图 A)、Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677(小图 B)或 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074(小图 C),对在 1x SDS 上样缓冲液(含 DTT)中还原和变性且浓度不断降低的总兔 IgG 进行蛋白质印迹分析。对于小图 A 和 B,使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 可检测到结合的小鼠抗兔 IgG mAb。还原和变性的兔 IgG 重链和轻链位置如图所示。

购买 # 3678S
产品货号 规格 价格 库存
3678S
100 µl

支持数据

反应性
敏感性
MW (kDa)
同型 小鼠 

产品说明

经亲和纯化的 mouse anti-rabbit IgG (Conformation Specific) antibody。本产品已经优化,可在蛋白质印迹实验应用中用作二抗。

存储:

-20°C

实验步骤

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蛋白质免疫印迹实验步骤(针对构象特异性抗体)

对于蛋白质印迹实验,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA 或 nonfat dry milk、1X TBS 和0.1% Tween-20 孵育,轻轻搅动,过夜。

注意:请参阅一抗数据表,以了解建议的一抗稀释缓冲液和建议的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format):(#7720)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb:(#3678)。
  16. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  17. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

下面描述了样品制备的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10-15 秒后完成全细胞裂解,并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 将 20 μl 样品加热至 95-100°C,时长 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 用微量离心机分离 5 分钟。
  7. 上样 20 μl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。注意:CST 建议上样预染色的分子量标记物(#7720,10 µl/泳道),以验证电转移和生物素化蛋白梯(#7727,10 µl/泳道),从而确定分子量。
  8. 电转移至硝酸纤维素或 PVDF 膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整容量。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移后,在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
  2. 膜在室温下用 25 ml 封闭液孵育 1 小时。
  3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 在 4°C 下,将膜和一抗(按照产品数据表中建议的适当稀释度)放在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育,轻轻搅动,过夜
  2. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜和 Mouse anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (1:2000) 放在 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动。
  4. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (#7076) (1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075) (1:1000) 放在 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动,以检测生物素化的蛋白标记物。
  6. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  7. 继续执行 D 部分的检测步骤。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2009 年 6 月 

修订于 2014 年 5 月

实验步骤编号:564

特异性/敏感性

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 可识别天然兔 IgG。它在蛋白质印迹实验中不会识别变性和还原的兔 IgG 重链(约 50 kDa)或轻链(约 25 kDa)。

来源/纯化

使用总天然兔 IgG 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 仅会与天然 IgG 发生反应,并且不会结合变性和还原的兔 IgG 重链或轻链。进行免疫沉淀 (IP) 后再进行蛋白质印迹实验时,用于进行免疫沉淀的一抗的变性兔 IgG 轻链和重链在随后的蛋白质印迹实验中分别约为 25 和 50 kDa,并且通常会掩盖分子量相似的蛋白条带。Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 用作二抗可避免这个问题。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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