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14679
Mono-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mix
蛋白质组分析产品

Mono-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mix #14679

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筛选器:
  1. WB

使用 Mono-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mix(上图)和 GAPDH (D61H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图),对未经处理 (-) 或已经腺苷-2',3'-二醛(AdOx,100 μM,24 小时;+)处理的 MCF7 细胞进行蛋白质印迹分析。

肽 ELISA 用于确定 Mono-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mix 的特异性。图表明,该抗体可识别单甲基化赖氨酸,并且与二甲基化或三甲基化赖氨酸以及甲基化精氨酸具有最低的交叉反应性。

购买 # 14679S
产品货号 规格 价格 库存
14679S
100 µl

支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

存储:

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗说明书或产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

蛋白质印迹法再标记实验步骤

在样品数量有限时,在现有的膜上反复单独检测多种蛋白进行免疫印迹分析来说是一种非常方便的方法。应注意的是,为了获得最好的结果,始终建议您进行新的印记实验以进行分析。重新检测是一种比较有效的方法,但在每一次重新检测印迹时,背景信号可能会增强。此外,建议您在进行重新检测前确认一抗复合体已被清除,以便与新抗体结合而产生的信号不是第一次免疫印迹实验的残余信号。这可通过再次将印迹暴露于 ECL 试剂并确保在添加下一个一抗前无信号来确认。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 洗涤缓冲液:Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) (#9997)
  2. 洗脱缓冲液:要制备 100 ml,可将 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巯基乙醇混合。使用去离子化 H20 补足至 100 ml。仅在使用前制备新鲜的缓冲液。

B. 实验步骤

  1. 胶片下曝光后,将膜置于 TBST 中清洗四次,每次 5 分钟。在膜未干燥的情况下才可获得最佳结果。
  2. 在 50°C 下,在膜再生液中将膜孵育 30 分钟,同时轻轻晃动。
  3. 在 TBST 中将膜清洗六次,每次 5 分钟。
  4. (可选)为了确保已清除原始信号,用 5 ml TBST 将膜清洗两次,每次 10 分钟。将膜与 LumiGLO® 在室温下孵育 1 分钟,同时轻轻搅动。将膜上多余的显影液沥干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射线胶片。
  5. 再次在 TBST 中将膜清洗四次,每次 5 分钟。
  6. 膜现在可以再次使用了。根据免疫印迹分析实验步骤中的“膜封闭和抗体孵育”步骤开始检测。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

仅当蛋白在某个赖氨酸残基上被单甲基化时,Mono-Methyl Lysine [mme-K] MultiMab™ Rabbit mAb mix 才能识别出内源水平的该种蛋白。虽然 ELISA 表明该抗体与二甲基化的赖氨酸具有最低的交叉反应性,但蛋白质印迹实验表明它不会与相应内源水平的甲基化精氨酸或二甲基化或三甲基化赖氨酸发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

预期的所有物种

来源/纯化

在获批应用中,通过以最佳比例混合个别兔单克隆可制备 MultiMab™ rabbit monoclonal antibody mix。混合物中的每种抗体都是根据多种测定法中的基序识别和性能严格筛选得来。每种混合物尽可能产生最大修饰覆盖范围,同时确保修饰或基序的高度特异性。

背景

赖氨酸残基的甲基化作用是一种常见的调控翻译后修饰 (PTM),会导致 ε 氨基组赖氨酸被蛋白赖氨酸甲基转移酶 (PKMT) 单甲基化、二甲基化或三甲基化。这两种 PKMT 组是根据结构和催化反应机制确定的;I 类甲基转移酶或七种 β 链酶以及含有 V 类甲基转移酶的 SET 结构域。两者均使用甲基供体 S 腺苷基 L 蛋氨酸实现组蛋白和非组蛋白甲基化。I 类甲基转移酶可使氨基酸、DNA 和 RNA 甲基化 (1,2)。六种甲基赖氨酸结合蛋白家族按结合域划分为:MBT、PHD 结构域、 Tudor、PWWP、WD40 复制和染色质域。许多蛋白会根据基于赖氨酸甲基化状态表现出不同的结合性 (3)。KDM1 亚科赖氨酸脱甲基酶可催化单甲基化和二甲基化赖氨酸脱甲基化,同时戊邻酮二酸盐依赖型 JmjC (KDM2-7) 亚科酶也可修饰三甲基化赖氨酸残基 (4)。

大多数 PKMT 底物均为组蛋白和转录因子,重点凸显出赖氨酸甲基化在调控染色质结构和基因表达中发挥的重要作用。G9A/GLP 可使组蛋白 H3 的 Lys9 单或二甲基化,SETDB1 可使组蛋白 H3 Lys9 三甲基化,以激活转录。相同残基的 JHDM3A 介导的脱甲基化作用可生成单甲基化 Lys9,并抑制基因转录 (5)。抑癌基因 p53 可由至少四个位点的甲基化作用调控。可通过 SMYD2 Lys370 P53 单甲基化抑制 p53 介导的转录;相同残基处的二甲基化可通过阻碍 53BP1 结合来进一步抑制 p53。在 Lys382 位点二甲基化可抑制 DNA 损伤后的 P53 泛素化。由 SET8 在 Lys382 位点单甲基化,可抑制 p53 转录活性,同时在 Lys372 位点 SET7/9 单甲基化可抑制在 Lys370 位点的 SMYD2 甲基化作用,使 p53 蛋白保持稳定。G9A/GLP 在 Lys373 位点二甲基化,可抑制 p53 介导的凋亡,并且与 p21 启动子处的组蛋白 H3 Lys9 三甲基化相关 (1,6)。PKMT 过表达与多种人类癌症相关,这对药物研发中靶定蛋白赖氨酸甲基转移酶发挥了重要作用。

  1. Lanouette, S. et al. (2014) Mol Syst Biol 10, 724.
  2. Clarke, S.G. (2013) Trends Biochem Sci 38, 243-52.
  3. Herold, J.M. et al. (2011) Curr Chem Genomics 5, 51-61.
  4. Thinnes, C.C. et al. (2014) Biochim Biophys Acta 1839, 1416-32.
  5. Klose, R.J. et al. (2006) Nature 442, 312-6.
  6. Yost, J.M. et al. (2011) Curr Chem Genomics 5, 72-84.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
MultiMab 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。
在某些方法中,使用 Cell Signaling Technology (CST) 基序抗体(例如,美国专利号 7,198,896 和 7,300,753)可能要求获得 CST 的许可证。关于学术许可条款信息,请您的技术转移办公室按照 CST_ip@cellsignal.com 联系 CST 法律部门。关于商业许可条款信息,请按照 ptmscan@cellsignal.com 联系 CST Pharma 服务部门。

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