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83732
Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb #83732

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R All 内源性 兔 IgG
蛋白质印迹法

使用 Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #(下图)对用以下组合处理方法处理 (+) 的 Colo 205 细胞进行蛋白质印迹分析,如下:用过氧化氢(500 μM,5 分钟)处理,或经过氧化氢处理的裂解物再用磷酸二酯酶 1(0.5 μg/mL,4 小时,在 37ºC 下)或 tcPARG(5 μM,4 小时,在 37ºC 下)处理5174。

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蛋白质印迹法

使用 Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb(上图)或 β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb #2128(下图)对未经 (-) 或已经过氧化氢(500μM,5 分钟;+)处理的 Colo 205 细胞进行蛋白质印迹分析。

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗说明书或产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个便利的试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液: (#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜和纸:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞(6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl)。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 取 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样以验证电转移与生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:以下体积数适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II.一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

蛋白质印迹法再标记实验步骤

在样品数量有限时,在现有的膜上反复单独检测多种蛋白进行免疫印迹分析来说是一种非常方便的方法。应注意的是,为了获得最好的结果,始终建议您进行新的印记实验以进行分析。重新检测是一种比较有效的方法,但在每一次重新检测印迹时,背景信号可能会增强。此外,建议您在进行重新检测前确认一抗复合体已被清除,以便与新抗体结合而产生的信号不是第一次免疫印迹实验的残余信号。这可通过再次将印迹暴露于 ECL 试剂并确保在添加下一个一抗前无信号来确认。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 洗涤缓冲液: Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) (#9997)
  2. 洗脱缓冲液:要制备 100 ml,可将 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml 、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巯基乙醇混合。使用去离子化 H20 补足至 100 ml。仅在使用前制备新鲜的缓冲液。

B. 实验步骤

  1. 胶片下曝光后,将膜置于 TBST 中清洗四次,每次 5 分钟。在膜未干燥的情况下才可获得最佳结果。
  2. 在 50°C 下,在膜再生液中将膜孵育 30 分钟,同时轻轻晃动。
  3. 在 TBST 中将膜清洗六次,每次 5 分钟。
  4. (可选)为了确保已清除原始信号,用 5 ml TBST 将膜清洗两次,每次 10 分钟。将膜与 LumiGLO® 在室温下孵育 1 分钟,同时轻轻搅动。将膜上多余的显影液沥干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射线胶片。
  5. 再次在 TBST 中将膜清洗四次,每次 5 分钟。
  6. 膜现在可以再次使用了。根据免疫印迹分析实验步骤中的“膜封闭和抗体孵育”步骤开始检测。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 10 月

实验步骤编号:10

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) RmAb 可检测 ADP 核糖基化蛋白的内源水平,但不会与其他翻译后修饰发生交叉反应。

物种反应性:

人,小鼠,大鼠,预期的所有物种

使用赖氨酸被 ADP 核糖修饰的 KLH 对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

ADP 核糖基化是一种翻译后修饰,这种修饰被发现会发生在多种受体残基(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸)的侧链和蛋白氨基末端以及 DNA 和 tRNA 上 (1)。ADP 核糖基化转移酶 (ADPRT) 会催化 ADP 核糖从 β-NAD+ 上发生转移,并在此过程中释放烟酰胺。单 ADP 核糖基化转移酶(MART 或单 PARP)包含大多数 ADPRT。这些单酶(包括去乙酰化酶和许多 PARP (ARTD) 和 ART 蛋白)可将单个 ADP 核糖单元转移到靶标残基(MAR 化)。聚 ADP 核糖聚合酶(聚 PARP)或多酶包括人 PARP1、2、5a 和 5b,它们是备受广泛研究的酶,并能聚合多达 200 个 ADPR 单元的线性链或支链 (2)。特异性主要(但不是只能)通过非连续性催化三联基序进行确定,其中有一些例外情况。这些含 R-S-E 基序的酶(如霍乱毒素)是精氨酸定向转移酶,而含 H-Y-E 三联基序的酶则显示出聚合酶活性 (3,4)。ADP 核糖基化是可逆的,聚 ADP 核糖甘油水解酶 (PARG) 或 ADP 核糖水解酶 3 (ARH3) 会将其分解为单个 ADP 核糖单元,或者 ARH1、TARG1、MacroD1 或 MacroD2 会将其从靶标残基上彻底去除 (5)。

ADP 核糖基化参与各种细胞进程,包括有丝分裂纺锤体形成、染色质解凝、细胞应激反应、逆转录病毒沉默、RNA 生物生成以及转录,但 ADP 核糖链的多数已知功能是还可作为将含 PAR 结合分子的 DNA 修复蛋白募集到 DNA 损伤位点的支架 (6)。X 射线修复交叉互补蛋白 1 (XRCC1)、组蛋白 macroH2A1、RNF146 (Iduna) (一种 E3 泛素连接酶),其中,许多 PARP 本身含有 PAR 结合基序 (PBM) 或结构域:WWE、PAR 结合锌指 (PBZ) 或大结构域 (7)。PAR 化在细胞存活中发挥核心作用,并受严格调控。PARP 缺损会让细胞容易出现 DNA 损伤诱导的凋亡,而高度 PAR 化则会导致一种特殊的细胞死亡(依赖性细胞死亡)(8)。PAR 化在 DNA 修复中的作用引发人们对开发 PARP 候选药物抑制剂产生了极大兴趣,尤其是用于治疗 BRCA1/2、CHK2 或 ATM 等 DNA 修复基因出现突变的乳腺癌、前列腺癌和小细胞肺癌的抑制剂。Stat1、PERK、p53、G-肌动蛋白和 Ras 只是在功能上受 ADP 核糖基化调控的蛋白的几个例子 (6,7)。ADP 核糖修饰会阻碍蛋白相互作用,或(如果是 P2X7)会导致构象变化,在有 ART2 表达的情况下,这种构象变化会使原初小鼠 T 细胞对胞外 NAD+ 敏感,从而导致凋亡 (9)。

  1. Koch-Nolte, F. et al. (2008) Front Biosci 13, 6716-29.
  2. Leung, A.K. (2014) J Cell Biol 205, 613-9.
  3. Laing, S. et al. (2011) Amino Acids 41, 257-69.
  4. Vyas, S. et al. (2014) Nat Commun 5, 4426.
  5. Vivelo, C.A. and Leung, A.K. (2015) Proteomics 15, 203-17.
  6. Gupte, R. et al. (2017) Genes Dev 31, 101-126.
  7. Wei, H. and Yu, X. (2016) Genomics Proteomics Bioinformatics 14, 131-139.
  8. David, K.K. et al. (2009) Front Biosci (Landmark Ed) 14, 1116-28.
  9. Seman, M. et al. (2003) Immunity 19, 571-82.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。

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