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4006
Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody
一抗
多克隆抗体

Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody #4006

引用 (5)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody

使用 Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody (上图) 或总 Na/K ATPase α1 Antibody#3010(下图),对未经处理或 TPA 处理的 PC-12 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

购买 # 4006S
产品货号 规格 价格 库存
4006S
100 µl

支持数据

反应性 R
敏感性 内源性
MW (kDa) 100
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. Incubate membrane and primary antibody (at the appropriate dilution and diluent as recommended in the product webpage) in 10 ml primary antibody dilution buffer with gentle agitation overnight at 4°C.
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Phospho-Na,K-ATPase α1 (Ser23) Antibody 仅在 Ser23 磷酸化后可识别内源水平的 Na,K-ATPase α1。Ser23 残基编号是基于蛋白质未成熟形式的序列,对应于成熟切割形式的 Ser18。

物种反应性:

大鼠

来源/纯化

使用与大鼠 Na,K-ATPase α1 的 Ser23 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用蛋白 A 和肽亲和力色谱对抗体进行纯化。

背景

Na,K-ATP 酶属于 P 型 ATP 酶家族的整合型膜异二聚体。这种离子通道使用来自 ATP 水解的能量,通过逆电化学梯度跨质膜驱动钠输出和钾输入而维持膜电位。它由催化性 α 亚基和 β 亚基组成(综述参见 1)。已经鉴定出 α1 亚基的几个磷酸化位点。Tyr10 由一种尚未确定的激酶磷酸化 (2),Ser16 和 Ser23 由 PKC 磷酸化,而 Ser943 由 PKA 磷酸化 (3-5)。所有这些位点均已涉及在激素和神经递质刺激下对酶活性的调节,从而改变 Na, K-ATP 酶的转运和动力学特性。血管紧张素 II 作用下改变的磷酸化可刺激大鼠近端小管中的活性 (6)。Na, K-ATP 酶还涉及其他信号转导通路。胰岛素调节其在分化的原代人骨骼肌细胞中的定位,并且这种调节作用取决于 α 亚基的 ERK1/2 磷酸化 (7)。Na, K-ATP 酶和 Src 可形成影响 Src 激酶活性调节过程并进而影响其下游效应物的信号转导受体复合体 (8,9)。

  1. Therien, A.G. and Blostein, R. (2000) Am J Physiol Cell Physiol 279, C541-66.
  2. Féraille, E. et al. (1999) Mol Biol Cell 10, 2847-59.
  3. Fisone, G. et al. (1994) J Biol Chem 269, 9368-73.
  4. Feschenko, M.S. and Sweadner, K.J. (1995) J Biol Chem 270, 14072-7.
  5. Beguin, P. et al. (1994) J Biol Chem 269, 24437-45.
  6. Yingst, D.R. et al. (2004) Am J Physiol Renal Physiol 287, F713-21.
  7. Al-Khalili, L. et al. (2004) J Biol Chem 279, 25211-8.
  8. Tian, J. et al. (2006) Mol Biol Cell 17, 317-26.
  9. Liang, M. et al. (2006) J Biol Chem 281, 19709-19.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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