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64508
Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb #64508

引用 (0)
筛选器:
  1. WB
  2. IF
Western Blotting Image 1 - Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb

对未经 (-) 或已经以下联合处理方法按规定处理的MCF7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析:用 Human Epidermal Growth Factor (hEGF) #8916(100ng/ml,15 分钟)或 hEGF 处理,随后再用牛小肠磷酸酶 (CIP) 和 λ 磷酸酶处理,使用 Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb(上图)或 Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb #8644(下图)。

Immunofluorescence Image 1 - Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb

使用 Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb(绿色),对未处理的(左上图)、经 Human Epidermal Growth Factor (hEGF) #8916(10 ng/mL,30 分钟;右上图)刺激或经 hEGF 刺激后再使用 λ 磷酸酶后处理(左下图)的血清饥饿 MCF7 细胞(ERα 阳性)进行共聚焦免疫荧光分析。经 hEGF 处理的 SK-BR-3 细胞(ERα 阴性;右下图)包括在内,作为附加阴性对照。肌动蛋白微丝由 DyLight554™13054 Phalloidin #(红色)进行标记。

购买 # 64508S
产品货号 规格 价格 库存
64508S
100 µl

支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 66
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号:24

特异性/敏感性

仅在 Ser167 位点磷酸化后,Phosho-Estrogen Receptor α (Ser167) (D5W3Z) Rabbit mAb 方可识别内源水平的 ERα。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 ERα 蛋白的 Ser167 周围残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

雌激素受体 α (ERα) 是类固醇受体超家族的一员,它包含高度保守的 DNA 结合域和配体结合域 (1)。通过其雌激素非依赖性和雌激素依赖性激活域(分别为 AF-1 和 AF-2),ERα 通过召集共激活因子蛋白并与一般转录机制相互作用来调节转录 (2)。多个位点的磷酸化是调节 ERα 活性的一个重要机制 (3-5)。Ser104、106、118 和 167 位于氨基末端转录激活功能域 AF-1,这些丝氨酸残基的磷酸化在调节 ERα 活性方面起着重要作用。Ser118 可能是转录调节性激酶 CDK7 的底物 (5)。Ser167 可能被 p90RSK 和 Akt 磷酸化 (4,6)。研究文献研究显示,Ser167 的磷酸化可能会使乳腺癌患者对他莫昔芬产生耐药性 (4)。

ERα 在 Ser167 位点被 S6K1、RSK 和 Aurora A 等不同激酶磷酸化 (7-9)。Ser167 位点的磷酸化可促进 ERα 依赖性转录和细胞增殖,这是因为对三苯氧胺处理的抗性增强 (6, 9, 10)。不同研究表明,Ser167 磷酸化增强与不同癌症类型的不良预后有关 (11, 12)

  1. Mangelsdorf, D.J. et al. (1995) Cell 83, 835-9.
  2. Glass, C.K. and Rosenfeld, M.G. (2000) Genes Dev 14, 121-41.
  3. Chen, D. et al. (1999) Mol Cell Biol 19, 1002-15.
  4. Campbell, R.A. et al. (2001) J Biol Chem 276, 9817-24.
  5. Chen, D. et al. (2000) Mol Cell 6, 127-37.
  6. Joel, P.B. et al. (1998) Mol Cell Biol 18, 1978-84.
  7. Yamnik, R.L. et al. (2009) J Biol Chem 284, 6361-9.
  8. Yamnik, R.L. and Holz, M.K. (2010) FEBS Lett 584, 124-8.
  9. Zheng, X.Q. et al. (2014) Oncogene 33, 4985-96.
  10. Wang, Y. et al. (2015) J Mol Endocrinol 54, 351-61.
  11. López-Calderero, I. et al. (2014) Hum Pathol 45, 2437-46.
  12. Kato, E. et al. (2014) Cancer Sci 105, 1307-12.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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