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84966
Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb #84966

引用 (9)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb

使用 Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb (上图)、Beclin-1 (D40C5) Rabbit mAb #3495 (中图) 或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457 (下图),对转染空载 (-) 或转染表达全长人 Beclin-1 蛋白 (hBeclin-1; +)、小鼠 Beclin-1 蛋白 (mBeclin-1; +) 或小鼠 ULK1 蛋白 (mULK1; +) 的表达载体的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

购买 # 84966S
产品货号 规格 价格 库存
84966S
100 µl

支持数据

反应性 H M
敏感性 转染性
MW (kDa) 60
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. Incubate membrane and primary antibody (at the appropriate dilution and diluent as recommended in the product webpage) in 10 ml primary antibody dilution buffer with gentle agitation overnight at 4°C.
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

特异性/敏感性

Phospho-Beclin-1 (Ser15) (D4B7R) Rabbit mAb 仅当 Ser15 (对应于小鼠的 Ser14 位点) 磷酸化后可识别转染水平的 Beclin-1 蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

来源/纯化

使用与人 Beclin-1 蛋白的 Ser15 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

自噬是自噬溶酶体降解蛋白质的一种分解代谢过程,由营养剥夺或神经退行性疾病引起 (1)。Beclin-1 是该过程中的关键蛋白之一,是哺乳动物中与酵母自噬蛋白 Apg6/Vps30 同源的基因 (2)。Beclin-1 可以补充由 Apg6 损失而造成的酵母自噬缺陷,在哺乳动物细胞中过表达时,可刺激细胞自噬 (3)。哺乳动物 Beclin-1 最初是从酵母双杂交筛选 Bcl-2 相互作用蛋白中分离出来,并且已经证明可以与 Bcl-2 和 Bcl-xL 相互作用,而不能与 Bax 或 Bak 相互作用 (4)。虽然 Beclin-1 一般普遍表达,但是研究发现在 40-75% 散发人乳腺癌和卵巢癌症中,其单等位基因缺失(5)。Beclin-1 主要位于胞浆结构中,包括线粒体,Beclin-1 过表达会引起核染色和 CRM1 依赖的出核转运 (6)。研究者发现 Beclin-1-/- 小鼠在胚胎发育早期就会死亡,而 Beclin-1-/+ 小鼠则有较高的自发肿瘤发病率。裸小鼠的干细胞的自噬反应改变,而对细胞凋亡的反应则正常 (7)。研究者还发现在体内病毒感染神经元时,Beclin-1 过表达能针对 Sindbis 病毒诱导的疾病和神经元凋亡产生显著保护作用 (4)。

自噬诱导剂(包括氨基酸饥饿和 mTOR 抑制)可导致丝氨酸/苏氨酸激酶 ULK1 在 Ser14 位点 (相当于人的 Ser15) 磷酸化小鼠 Beclin-1 。这可导致 VPS34 脂质激酶活性增加并诱导自噬 (8)。

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot Cell 1, 11-21.
  2. Kametaka, S. et al. (1998) J Biol Chem 273, 22284-91.
  3. Liang, X.H. et al. (1999) Nature 402, 672-6.
  4. Liang, X.H. et al. (1998) J Virol 72, 8586-96.
  5. Aita, V.M. et al. (1999) Genomics 59, 59-65.
  6. Liang, X.H. et al. (2001) Cancer Res 61, 3443-9.
  7. Yue, Z. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 15077-82.
  8. Russell, R.C. et al. (2013) Nat Cell Biol 15, 741-50.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。

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