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92340
Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb
一抗

Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb #92340

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使用 Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb(上图)、Atg14 (D1A1N) Rabbit mAb(中图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图),对转染空载 (-) 或转染表达带有 GFP 标签的人 Atg14 蛋白 (hAtg14-GFP; +) 或小鼠 ULK1 蛋白 (mULK1; +) 表达载体的 293T 细胞提取物进行蛋白印迹分析。

使用 Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb(上图)、Atg14 (D1A1N) Rabbit mAb #96752(中间)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb(下图),对未经处理 (-) 或用 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS,2 小时;+)和 ULK1 抑制剂 SBI-0206965 #29089(50 μM,2 小时;+)(如图所示)饥饿的 HCT 116 和 HCT 116/Atg14 shRNA 敲除型细胞的提取物进行蛋白印迹分析。HCT 116/Atg14 shRNA 敲除型细胞由明尼苏达州明尼阿波利斯明尼苏达大学的 Do-Hyung Kim 博士惠赠。

使用 Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb(上图)、Atg14 (D1A1N) Rabbit mAb #96752(中图)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图),对未经 (-) 或已经 λ-磷酸酶和牛小肠磷酸酶(λ-磷酸酶/CIP ;+) 处理的 HCT 116 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

使用 Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb(上图)、Atg14 (D1A1N) Rabbit mAb #96752(中间)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (-) 或用 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS,2 小时)饥饿的 Saos-2 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

使用 Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb(绿色)对未经(左图,低表达)或经 Torin 1 #14379(250 nM,2 小时;中间-左图,高表达)处理的 HCT 116 Atg14 野生型细胞、经 Torin 1(中间-右图,阴性)处理的 HCT 116/Atg14 shRNA 敲除型细胞或经 λ-磷酸酶(2 小时,右图,阴性)进行后处理的 HCT 116 Atg14 野生型细胞进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。HCT 116/Atg14 shRNA 敲除型细胞由明尼苏达州明尼阿波利斯明尼苏达大学的 Do-Hyung Kim 博士惠赠。

购买 # 92340S
产品货号 规格 价格 库存
92340S
100 µl

支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa) 65
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:800

存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗说明书或产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

蛋白质印迹法再标记实验步骤

在样品数量有限时,在现有的膜上反复单独检测多种蛋白进行免疫印迹分析来说是一种非常方便的方法。应注意的是,为了获得最好的结果,始终建议您进行新的印记实验以进行分析。重新检测是一种比较有效的方法,但在每一次重新检测印迹时,背景信号可能会增强。此外,建议您在进行重新检测前确认一抗复合体已被清除,以便与新抗体结合而产生的信号不是第一次免疫印迹实验的残余信号。这可通过再次将印迹暴露于 ECL 试剂并确保在添加下一个一抗前无信号来确认。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 洗涤缓冲液:Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) (#9997)
  2. 洗脱缓冲液:要制备 100 ml,可将 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巯基乙醇混合。使用去离子化 H20 补足至 100 ml。仅在使用前制备新鲜的缓冲液。

B. 实验步骤

  1. 胶片下曝光后,将膜置于 TBST 中清洗四次,每次 5 分钟。在膜未干燥的情况下才可获得最佳结果。
  2. 在 50°C 下,在膜再生液中将膜孵育 30 分钟,同时轻轻晃动。
  3. 在 TBST 中将膜清洗六次,每次 5 分钟。
  4. (可选)为了确保已清除原始信号,用 5 ml TBST 将膜清洗两次,每次 10 分钟。将膜与 LumiGLO® 在室温下孵育 1 分钟,同时轻轻搅动。将膜上多余的显影液沥干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射线胶片。
  5. 再次在 TBST 中将膜清洗四次,每次 5 分钟。
  6. 膜现在可以再次使用了。根据免疫印迹分析实验步骤中的“膜封闭和抗体孵育”步骤开始检测。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 10 月

实验步骤编号:10

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醇,100%
  3. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 冰冷的 100% 甲醇。
  2. 在 -20°C 温度下,可让细胞固定15分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 温度下孵育过夜
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  9. 为达到最佳效果,应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2010 年 12 月 

实验步骤编号:3

特异性/敏感性

Phospho-Atg14 (Ser29) (D4B8M) Rabbit mAb 可检测仅在 Ser29 位点被磷酸化的内源水平的 Atg14 蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 Atg14 蛋白中 Ser29 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

自噬是自噬溶酶体降解大部分细胞浆内容物的一种分解代谢过程 (1,2)。自噬一般在营养匮乏的条件下被激活,但也与许多生理过程有关,包括发育、分化、神经退行性疾病、感染和癌症 (3)。已在酵母中大量发现自噬的分子机制,该机制还受大量自噬相关 (Atg) 基因的调节。这些蛋白参与自噬体的形成,自噬体是被转运到溶酶体中进行降解的胞质液泡。III 型磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) Vps34 可调节液泡转运和自噬 (4,5)。Vsp34 可结合许多蛋白,包括 p105/Vsp15、Beclin-1、UVRAG、Atg14 和 Rubicon,从而确定 Vsp34 的功能 (6-12)。Atg14 和 Rubicon 根据其结合 Beclin-1 的能力进行鉴定,并在独特复合体中发挥抑制作用 (9-12)。位于内体和溶酶体的 Rubicon 会抑制 Vps34 脂质激酶活性;敲除 Rubicon 会增强自噬和内吞转运 (11,12)。相比之下,Atg14 位于自噬体、隔离膜和内质网,并可增强 Vps34 活性。敲除 Atg14 会抑制饥饿诱导的自噬 (11,12)。

丝氨酸/苏氨酸激酶 ULK1 在 Ser29 位点磷酸化 Atg14 可促进自噬体形成 (13)。

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot Cell 1, 11-21.
  2. Codogno, P. and Meijer, A.J. (2005) Cell Death Differ 12 Suppl 2, 1509-18.
  3. Levine, B. and Yuan, J. (2005) J Clin Invest 115, 2679-88.
  4. Corvera, S. (2001) Traffic 2, 859-66.
  5. Yan, Y. and Backer, J.M. (2007) Biochem Soc Trans 35, 239-41.
  6. Stack, J.H. et al. (1995) J Cell Biol 129, 321-34.
  7. Zeng, X. et al. (2006) J Cell Sci 119, 259-70.
  8. Liang, C. et al. (2006) Nat Cell Biol 8, 688-99.
  9. Itakura, E. et al. (2008) Mol Biol Cell 19, 5360-72.
  10. Sun, Q. et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105, 19211-6.
  11. Zhong, Y. et al. (2009) Nat Cell Biol 11, 468-76.
  12. Matsunaga, K. et al. (2009) Nat Cell Biol 11, 385-96.
  13. Park, J.M. et al. (2016) Autophagy 12, 547-64.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
ProLong 是 Life Technologies 公司的注册商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。

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