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3787
Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb

Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb #3787

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M 内源性 60 兔 IgG
IHC-P(石蜡)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 对石蜡包埋的且显示细胞浆和细胞核定位的人乳腺癌细胞进行免疫组织化学分析。

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IHC-P(石蜡)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。

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IHC-P(石蜡)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 对 SignalSlide (R) Phospho-Akt (Ser473) IHC Controls #8101(未经处理(左图)或已经 LY294002 (右图)处理的石蜡包埋的 LNCaP 细胞)进行免疫组织化学分析。

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IHC-P(石蜡)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 对用无关肽(左图)或 Phospho-Akt (Ser473) Blocking Peptide (#1140)(右图)预孵育的石蜡包埋的人前列腺癌细胞进行免疫组织化学分析。

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IHC-P(石蜡)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb (左图)或 PTEN (138G6) Rabbit mAb #9559(右图)对石蜡包埋的 MDA-MB-468 异种移植物进行免疫组织化学分析。MDA-MB-468 细胞缺乏 PTEN。注意:PTEN 缺失型细胞中存在 P-Akt。

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IHC-F(冰冻)

使用 Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 对显示主要定位于细胞浆的冰冻 U-87MG 异种移植物进行免疫组织化学分析。

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免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
  3. 去离子水 (dH2O)
  4. Hematoxylin(可选)
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备,添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统: VECTASTAIN® Elite ABC,包括生物素化二抗 (Vector Laboratories)。
  11. 底物:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 除去封闭液,并给每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜
  7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
  8. 清除一抗,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗(根据制造商建议在 TBST 中进行稀释)。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除二抗溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片,并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
  12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  13. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  14. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察,通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
  15. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  16. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  17. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  18. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 3 月

实验步骤编号:303

免疫组织化学(冰冻)

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇(无水变性,组织级 100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 固定液: 3% 甲醛。
    1. 要制备 100 ml 溶液,将 18.75 ml 16% 的甲醛加入到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
  5. 洗涤缓冲液: 1X Tris 盐缓冲液 (TBS)。

    要制备 1L 1X TBS, 将 100 ml 10X Tris Buffered Saline (#12498) 到 900 ml dH2O中, 搅拌混匀。

  6. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  7. 封闭液: 1X TBS/0.3% Triton X-100/5% Normal Goat Serum 或 1X 无动物成分封闭液。
    1. 1X TBS/0.3% Triton X-100/5% Normal Goat Serum: 将 500 µl Normal Goat Serum (#5425) 和 30 µl Triton X-100 加入 9.5 ml 1X TBS中。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  8. Antibody Diluent 1X TBS/0.3% Triton™ X-100/5% Normal Goat Serum: 将 500 µl Normal Goat Serum (#5425) 和 30 µl Triton™ X-100 加入 9.5 ml 1X TBS中。
  9. 检测系统:VECTASTAIN® Elite ABC,包括生物素标记二抗 (Vector Laboratories)。
  10. 底物:Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
  11. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  12. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 切片制作

  1. 对于在 -80°C 下储存的组织:切片前先将其从冷冻柜中取出并在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
  2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片,并将其置于带正电荷的载玻片上。
  3. 固定前,将切片放置在工作台上风干几分钟(这样有助于加强切片与载玻片之间的黏附)。

C. 固定

  1. 室温下在 3% 甲醛中固定切片 15 分钟。立即进入染色步骤(D 部分)。

D. 染色

  1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  2. 在室温下将其放在 3% 的过氧化氢中孵育 10 分钟。
  3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  4. 在室温下用 100-400 µl 的首选封闭液封闭各切片 1 小时。
  5. 清除封闭液,然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。
  6. 在 4 °C 温度下过夜孵育。
  7. 根据制造商建议说明制备 ABC 溶液。
  8. 清除一抗,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 在每个切片中添加 100-400 µl 的生物素化二抗(根据制造商的建议,在洗涤缓冲液中稀释)。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除二抗溶液,并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 按需使用 100-400 µl 预混合 ABC 溶液覆盖切片,并在湿盒中室温孵育 30 分钟。
  12. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  13. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  14. 在每个切片上涂 100–400 µl 底物,并密切观察。通常 1– 10 分钟即可得到合格的染色强度。
  15. 将切片浸入 dH2O 中。
  16. 如有需要,可复染 hematoxylin (#14166) 切片。
  17. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  18. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  19. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

发布​于 2006 年 1 月 

修订于 2016 年 3 月

实验步骤编号:330

应用 稀释度
免疫组织化学(石蜡) 1:50
免疫组织化学(冰冻) 1:50
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

Phospho-Akt (Ser473) (736E11) Rabbit mAb 仅在丝氨酸 473 位点被磷酸化后可识别 Akt1,以及仅在同等位点被磷酸化的 Akt2 和 Akt3。

物种反应性:

人,小鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

大鼠

使用与小鼠 Akt 中 Ser473 周围的残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Akt也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14),并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16),参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是,Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)(在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子)(18,19)。

  1. Franke, T.F. et al. (1997) Cell 88, 435-7.
  2. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.
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  18. Inoki, K. et al. (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.
  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.
Entrez-Gene Id
207 , 208 , 10000
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P31751 , Q9Y243
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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