对促销感兴趣? | 点击此处 >>
65713
PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel
一抗
IHC 试剂盒

PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel #65713

引用 (0)
mIHC Image 1 - PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel

使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb (绿色)、CD3ε (D7A6E™) XP® Rabbit mAb(黄色)和 CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) (红色)对石蜡包埋的人乳腺癌细胞进行多重荧光免疫组织化学分析。蓝色伪彩 = DAPI #8961(DNA 荧光染料)。图像采集使用多谱段摄影机进行。

mIHC Image 2 - PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel

使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb (绿色)、CD3ε (D7A6E™) XP® Rabbit mAb (黄色)和 CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific)(红色)对石蜡包埋的人扁桃体细胞进行多重荧光免疫组织化学分析。蓝色伪彩 = DAPI #8961(DNA 荧光染料)。图像采集使用多谱段摄影机进行。

购买 # 65713T
产品货号 规格 价格 库存
65713T
1 个试剂盒(50 块切片)

产品包括 数量
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb 20 µl
CD3ε (D7A6E™) XP® Rabbit mAb 20 µl
CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) 20 µl

实验步骤

打印

查看 > 折叠 >

针对使用酪胺信号放大技术的多重荧光免疫组织化学 (mIHC) 实验步骤

A. 溶液、试剂和试剂盒

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 抗原修复液:
    1. 柠檬酸: 10 mM 柠檬酸钠,pH 6.0

      要制备 500 ml 1X 柠檬酸修复液:添加 50 ml SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746 到 450 ml dH2O 中。

    2. EDTA: 1 mM EDTA,pH 8.0

      要制备 500 ml 1X EDTA 修复液:添加 50 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747 到 450 ml dH2O 中。

  5. 3% 过氧化氢
    1. 要制备 500 ml 3% H2O2:添加 50 ml 30% H2O2 到 450 ml dH2O 中。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 洗涤缓冲液:1X Tris Buffered Saline with Tween®20 (TBST)
    1. 要制备 1L 1X TBST:添加 100 ml 10X TBST #9997 到 900 ml dH2O 中。
  8. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP rabbit, #8114; HRP mouse, #8125)。
  9. TSA® Plus Fluorescein kit (Akoya Biosciences, NEL741001KT)。
  10. TSA® Plus Cyanine 5 kit (Akoya Biosciences, NEL745001KT)。
  11. TSA® Plus Cyanine 3 kit (Akoya Biosciences, NEL744001KT)。
  12. 剥离溶液: 10 mM 柠檬酸钠,pH 6.0
    1. 要制备 500 ml 10 mM 柠檬酸溶液:添加 50 ml SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746 到 450 ml dH2O 中。
  13. ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961

B. 实验步骤概述

涉及酪胺信号放大技术 (TSA®) 的荧光 mIHC 是一项能在给定组织切片上以逐步增加能量的方式同时检测多种目的蛋白的方法。其检测是通过涉及一抗和二抗的间接免疫荧光法促进信号放大来进行。

在下述实验步骤中,HRP 标记的二抗结合对靶标/目的抗原具有特异性的未标记一抗。最终检测到的荧光团标记酪胺分子可作为 HRP 的底物。激活的酪胺与目的蛋白上或周围的酪氨酸残基形成共价键,并永久性沉淀在抗原位点。这在维持抗原相关荧光信号的同时,可连续剥离一抗/二抗对,使得这个过程可以按顺序进行多轮染色。重要的是,这种方法的其中一个关键优势在于可以使用同一物种的多种一抗,而无需担心会发生交互作用。这可大大简化多重检测板设计过程。

C. 重要提示

影响酪胺的多重荧光 IHC 实验成功的因素有很多。

一抗浓度:多重检测板中每种一抗的最佳稀释度必须凭经验确定,并且通常可能因酪胺沉淀引起的荧光信号放大与制造商建议的稀释度存在很大不同。我们强烈建议使用中等强度的荧光团对每种组分进行滴定,来优化多重检测板的个别组分。

顺序优化:对多重检测板中的抗体在组织切片上的应用顺序进行优化是确保多轮加热不会损坏靶标特异性表位的关键步骤。我们建议使用中等强度的荧光团来检测多重检测板每个窄缝中的所有优化一抗,以确保荧光信号不受检测板内相对位置的影响。

抗体-荧光团配对:通常,通过使用最亮的荧光团检测表达水平最低的靶标来配对抗体是一种很好的做法。我们建议检测由优化的一抗组成的基质和每种可用的荧光团,以获得检测板上每种靶标的最佳信号强度和信噪比。

D. 实验步骤

  1. 烘干载玻片(可选)
    1. 水平放置载玻片并在 60°C 下孵育 1.5 小时。
    2. 将载玻片从水平位置恢复到垂直位置,并在 60°C 下再孵育 30 分钟。

    注意:这个步骤允许固体石腊融化。

  2. 脱蜡/复水
    1. 孵育载玻片,在二甲苯中洗涤 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    4. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

    注意:在室温下轻轻搅动来完成所有洗涤过程。

  3. 抗原修复

    注意:请参阅产品数据表,了解有关要对多重检测板中每种一抗使用的最佳修复液的建议。如果多重检测板包括一种建议与 EDTA 修复液搭配使用的抗体,则使用 EDTA 作为修复液。

    对于柠檬酸:

    1. 使用一个微波炉,并将载玻片放入 pH 6.0 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中煮沸。
    2. 在亚沸温度下保持 10 分钟。
    3. 将载玻片放置在台上,冷却到室温,持续 30 分钟。

    对于 EDTA:

    1. 使用一个微波炉,并将载玻片放入 1 mM EDTA 中煮沸,pH 8.0。
    2. 在亚沸温度下保持 15 分钟。无需冷却。
  4. 猝灭
    1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
    2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
    4. 在 1X TBST 洗涤切片 5 分钟。
  5. 染色/检测

    注意:可对组织切片进行单独预封闭,但不是必须要求。一抗的最佳稀释度必须凭经验确定。

    1. 在 SignalStain® Antibody Diluent #8112 中稀释一抗。
    2. 向每个切片添加 100-400 μl 并在加湿箱中室温孵育 60 分钟。
    3. 在与一抗孵育期间,让 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP rabbit, #8114 or HRP mouse, #8125) 平衡至室温。
    4. 清除抗体溶液,并用 1X TBST 洗涤切片 2 次,每次 3 分钟。
    5. 在组织切片上滴几滴 (100-400 μl) 对一抗种类具有特异性的 SignalStain® Boost IHC detection Reagent (HRP rabbit, #8114 or HRP mouse, #8125)。
    6. 在加湿箱中室温孵育 30 分钟,避光保存。
    7. 用 1X TBST 洗涤载玻片 2 次,每次 3 分钟,轻轻搅动,并避光保存。
  6. 酪胺信号放大技术 (TSA®)

    注意:选择合适的 Fluorophore-conjugated TSA® Plus Amplification Reagent 时,考虑靶标表达水平和荧光团强度非常重要。一抗和荧光团的最佳配对应提前进行(参见上文的重要提示)。

    1. 根据制造商的建议稀释 Fluorophore-conjugated TSA® Plus Amplification Reagent。
    2. 每块载玻片使用 100-400 μl,并在加湿箱中室温孵育 10 分钟,避光保存。
    3. 用 1X TBST 洗涤载玻片 2 次,每次 3 分钟,轻轻搅动,并避光保存。
  7. 连续染色
    1. 如果进行多重染色(要检测多个目的靶标):
      1. 继续进行剥离 (步骤 8)
    2. 如果已完成多重检测板染色或正在进行单重检测(已检测到一个目的靶标):
      1. 继续进行封片 (步骤 9)
  8. 剥离
    1. 使用一个微波炉,并将载玻片放入 pH 6.0 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中煮沸。
    2. 在亚沸温度下保持 10 分钟。
    3. 将载玻片放置在台上,冷却到室温,持续 30 分钟。
      使用一种不同的酪胺-荧光团接合物继续进行 染色/检测(步骤 5)
  9. 封片
    使用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 对盖玻片进行封片。

    注意:如果载玻片用于组成波谱库的目的,则应使用 ProLong® Gold Antifade Reagent #9071

发布​于 2016 年 4 月 

实验步骤编号:1065

产品说明

PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel 能够让研究人员使用酪胺信号放大技术来检测石蜡包埋的组织中的这些靶标。已经运用检测板中的每种抗体对这种方法进行了验证。如需了解针对该抗体检测板特别优化的建议染色条件,请参阅数据表中的表 1。

特异性/敏感性

该检测板中的每种抗体均可识别内源水平的特定靶标蛋白。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 PD-L1 蛋白中羧基末端周围的残基、人 CD3ε 蛋白中 Glu178 周围的残基或人 CD8α 蛋白中羧基末端周围的残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

癌症免疫治疗领域关注于让免疫系统能够对抗癌症。目前,通过在临床中使用靶向免疫检查点调控蛋白(如 PD-1)已见证了这种方法的成功 (1,2)。尽管获得了这样的成功,但预测对涉及 PD-1 受体阻断的治疗策略有反应的临床生物标记物尚在研究中 (3-5)。PD-L1 表达与抗 PD-L1 治疗后的反应机率增加有关,研究表明,肿瘤免疫浸润和肿瘤细胞内效应子/调节性 T 细胞比例等其他因素也在预测治疗结果的过程中发挥重要作用 (6-9)。

程序性细胞死亡蛋白 1 配体 1 (PD-L1) 是细胞表面配体 B7 家族的一员,该家族可调控 T 细胞激活和免疫应答。PD-L1 配体结合 PD-1 跨膜受体并抑制 T 细胞激活。PD-L1 在黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和肾细胞癌等许多肿瘤类型的细胞中表达 (10-12)。

CD3(分化抗原簇 3)是一种直接结合 T 细胞受体 (TCR) 的多亚基蛋白复合体。CD3 由四个多肽(ζ、γ、ε 和 δ)组成,每个多肽包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM) (13)。TCR 复合体与外来抗原的接合在 ITAM 基序中诱导酪氨酸磷酸化,并且磷酸化的 ITAM 作为信号转导分子(如 ZAP-70 和 PI-3 激酶的 p85 亚基)的对接位点发挥作用 (14,15)。

CD8(分化抗原簇 8)是一种包含 α 和 β 亚基的二硫键连接的异二聚体。在 T 细胞中,CD8 是 TCR 的共同受体,通过这两个不同的结构可识别抗原-主要组织相容性复合体 (MHC)。CD8 可确保 TCR-抗原相互作用的特异性,并延长 T 细胞和抗原呈递细胞之间的接触时间,α 链能募集酪氨酸激酶 Lck,这对 T 细胞激活非常重要 (16)。

  1. Topalian, S.L. et al. (2012) N Engl J Med 366, 2443-54.
  2. Piccinini, M. et al. (2014) Comput Methods Biomech Biomed Engin 17, 1403-17.
  3. Chakravarti, N. and Prieto, V.G. (2015) Transl Lung Cancer Res 4, 743-51.
  4. Sholl, L.M. et al. (2016) Arch Pathol Lab Med , .
  5. Carbognin, L. et al. (2015) PLoS One 10, e0130142.
  6. Tokito, T. et al. (2016) Eur J Cancer 55, 7-14.
  7. Tumeh, P.C. et al. (2014) Nature 515, 568-71.
  8. Feng, Z. et al. (2015) J Immunother Cancer 3, 47.
  9. Baine, M.K. et al. (2015) Oncotarget 6, 24990-5002.
  10. Zamoyska, R. (1994) Immunity 1, 243-46.
  11. Pitcher, L.A. and van Oers, N.S. (2003) Trends Immunol 24, 554-60.
  12. Osman, N. et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26, 1063-1068.
  13. Dong, H. et al. (2002) Nat Med 8, 793-800.
  14. Hatada, M.H. et al. (1995) Nature 377, 32-38.
  15. Thompson, R.H. et al. (2006) Cancer Res 66, 3381-5.
  16. Pardoll, D.M. (2012) Nat Rev Cancer 12, 252-64.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
D7A6E 是 Cell Signaling Technology 的商标。Inc. 的商标。
E1L3N 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Cy3 是 GE Healthcare 的注册商标。
Cy5 是 GE Healthcare 的注册商标。

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink