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4990
NALP1 Antibody
一抗
多克隆抗体

NALP1 Antibody #4990

引用 (8)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - NALP1 Antibody

使用 NALP1 Antibody,对来自 K-562 细胞和 SH-SY5Y 细胞和来自大鼠睾丸的提取物进行蛋白质印迹分析。

购买 # 4990S
产品货号 规格 价格 库存
4990S
100 µl

支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa) 165, 70
来源

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10mM sodium HEPES(pH 为 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA 和 50% 甘油中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

NALP1 Antibody 可检测 NALP1 总蛋白的内源水平。这种抗体还检测到与预测的短蛋白(NALP1s) 相关的 70 kDa 蛋白质 ,这种短蛋白缺少亮氨酸重复序列区 (7)。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

来源/纯化

通过采用与人 NALP1 蛋白的 Gly1081 周围的区域相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生多克隆抗体。使用肽亲和力色谱对抗体进行纯化。

背景

NALP1 (DEFCAP/NAC/CARD7) 是已证明涉及调节凋亡和炎症反应的 NLR(Nod 样受体)家族成员 (1-5)。在结构上,NALP 含有一个氨基末端 PYRIN 结构域,后跟一个核苷酸结合位点 (NBS)、一个亮氨酸丰富重复序列区 (LRR) 和一个羧基末端 CARD 结构域。NALP1 与Caspase-2 强相互作用,但与Caspase-9 弱相互作用,并在过表达时诱导凋亡 (3)。它与相关 Ced-4 家族成员 Apaf-1 类似,并且还证实参与细胞色素 C-依赖性 caspase 的激活 (2)。还已经证实它是由Caspase-1、Caspase-5 和 Pycard/ASC 组成的“炎性小体”的组成部分,该炎性小体在加工促炎细胞因子(如 IL-1β)中至关重要 (6)。鉴定到 NALP1 的两个主要同工型,其差异在于 LRR 内部的 44氨基酸区域 (3)。此外,如同 NALP3,或许存在缺少 LRR 的短 NALP1 同工型 (NALP1s)  (7)。NALP1 中的多态性与自身免疫性疾病 (8) 和毒素敏感性 (9) 相关。

  1. Bertin, J. and DiStefano, P.S. (2000) Cell Death Differ. 7, 1273-1274.
  2. Chu, Z.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9239-9245.
  3. Hlaing, T. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9230-9238.
  4. Martinon, F. et al. (2001) Curr. Biol. 11, R118-R120.
  5. Fritz, J.H. et al. (2006) Nat. Immunol. 7, 1250-1257.
  6. Martinon, F. et al. (2002) Mol Cell 10, 417-26.
  7. Kummer, J.A. et al. (2007) J. Histochem. Cytochem. 55, 443-452.
  8. Jin, Y. et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356, 1216-1225.
  9. Boyden, E.D. and Dietrich, W.F. (2006) Nat. Genet. 38, 240-244.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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