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4499
Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb #4499

引用 (413)
筛选器:
  1. WB
  2. IHC
  3. IF
  4. F
Western Blotting Image 1 - Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb

使用 Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

Immunohistochemistry Image 1 - Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb

使用 Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行免疫组织化学分析。

Immunofluorescence Image 1 - Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb

使用 Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb(绿色)和 β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #2116(红色)对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。

Flow Cytometry Image 1 - Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb

使用 Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb(蓝色)对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(红色)对人体外周血淋巴细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414 作为二抗。

购买 # 4499S
产品货号 规格 价格 库存
4499T
20 µl
4499S
100 µl
4499L
300 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 17
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:2000
免疫组织化学(石蜡) 1:400
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:400
流式细胞术 1:50

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗,考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:283

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:32

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

特异性/敏感性

Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb 可检测 H3 总组蛋白(包括同工型 H3.1、H3.2 和 H3.3)的内源水平。该抗体还可以检测组蛋白 H3 变异体 CENP-A。该抗体不会与其他核心组蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

仓鼠 , 鸡 , 黑腹果蝇 , 非洲爪蟾蜍, 斑马鱼 , 牛

来源/纯化

使用与人组蛋白 H3 羧基末端相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

染色质结构调节在真核生物的转录调控中扮演着重要角色。核小体是染色质的基本结构单位,由 DNA 缠绕八个核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4 各 2 个)组成 (1)。核心组蛋白的氨基端尾部常发生多种翻译后修饰,包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化 (2-5)。这些修饰都是针对不同刺激而产生的反应,且会直接影响染色质对转录因子的可接近性,进而影响基因表达 (6)。在多数物种中,组蛋白 H2B 乙酰化主要发生在 Lys5、12、15和 20 位点上 (4,7)。而组蛋白 H3 的乙酰化则主要发生在 Lys9、14、18、23、27 和 56 位点上。在一些生物体内,在 Lys9 位点 H3 的乙酰化修饰似乎对组蛋白沉积和染色质组装有决定性的作用 (2,3)。组蛋白 H3 在 Ser10、Ser28 和 Thr11 位点上的磷酸化与有丝分裂和减数分裂期间的染色体浓缩紧密相关 (8-10)。组蛋白 H3 在 Thr3 位点上的磷酸化在许多物种中是高度保守的,并由激酶 haspin 催化完成。在哺乳动物细胞内用磷酸化特异性抗体进行免疫染色,发现有丝分裂中 H3 在 Thr3 位点的磷酸化发生在前期,而去磷酸化则发生在后期 (11)。

  1. Workman, J.L. and Kingston, R.E. (1998) Annu Rev Biochem 67, 545-79.
  2. Hansen, J.C. et al. (1998) Biochemistry 37, 17637-41.
  3. Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000) Nature 403, 41-5.
  4. Cheung, P. et al. (2000) Cell 103, 263-71.
  5. Bernstein, B.E. and Schreiber, S.L. (2002) Chem Biol 9, 1167-73.
  6. Jaskelioff, M. and Peterson, C.L. (2003) Nat Cell Biol 5, 395-9.
  7. Thorne, A.W. et al. (1990) Eur J Biochem 193, 701-13.
  8. Hendzel, M.J. et al. (1997) Chromosoma 106, 348-60.
  9. Goto, H. et al. (1999) J Biol Chem 274, 25543-9.
  10. Preuss, U. et al. (2003) Nucleic Acids Res 31, 878-85.
  11. Dai J et al. (2005) Genes Dev 19, 472–88

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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