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5292
BrdU (Bu20a) Mouse mAb
一抗

BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

引用 (59)
筛选器:
  1. IHC
  2. IF
  3. F

使用 BrdU (Bu20a) Mouse mAb 对无 BrdU 掺入(左)和有 BrdU 掺入(右)的石蜡包埋的 HeLa 细胞进行免疫组织化学分析。

使用 BrdU (Bu20a) Mouse mAb(绿色)对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

对比 DRAQ5® (DNA 含量),使用 BrdU (Bu20a) Mouse mAb ,对掺入 BrdU(30 分钟)的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

使用 BrdU (Bu20a) Mouse mAb 与碘化丙啶(DNA 含量)对 BrdU 掺入(30 分钟)的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

使用 BrdU (Bu20a) Mouse mAb 对未经处理(蓝色)或 BrdU 掺入 30分钟(绿色)的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

购买 # 5292S
产品货号 规格 价格 库存
5292S
100 µl

支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 小鼠 IgG1

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫组织化学(石蜡) 1:200
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:1000
流式细胞术 1:200

存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 让 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 按需在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Mouse #8125)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2016 年 3 月

实验步骤编号:280

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中,混合均匀。调节 pH 至 8.0。
  2. BrdU(5-溴-2′-脱氧尿苷)EMD biosciences (Cat. #203806)
  3. 乙醇,变性 70%,溶液,American Bioanalytical (Cat. #CU00844)
  4. 1.5 M 盐酸
  5. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清):
    要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 到 9.0 mL dH2O 中,混合均匀。
  6. Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 1% BSA):添加 0.1 g BSA (#9998) 到 10 ml 1X PBS 中,混合均匀。
  7. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  8. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

BrdU 掺入:在新鲜预热的生长培养基中稀释 BrdU,至最终浓度为 0.03 mg/mL。向细胞中加入混合物后在 37°C 下孵育 30 分钟。

  1. 吸干培养基后用冷却的 70% 乙醇完全浸没细胞。
  2. 室温下固定细胞 5 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 加入 1.5M HCl 后在室温下孵育 30 分钟。
  5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次,每次 5 分钟。
  6. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 温度下孵育过夜
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 按步骤 5 使用 1X PBS 漂洗。
  8. 用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961) 浸没载玻片或在多孔板上用足够量浸没细胞。
  9. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2009 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:33

流式细胞术

A. 溶液和试剂

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH2O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4,使其容量达到 1 升。室温保存。
  2. BrdU(5-溴-2′-脱氧尿苷)EMD biosciences (Cat. #203806)
  3. 乙醇,无水变性,组织学级,100% 和 95%
  4. 1.5M 盐酸
  5. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解至 100 mL 1X PBS 中。储存在 4°C。
  6. 建议使用 Anti-Mouse 二抗

B. BrdU 掺入和样本制备

  1. 在新鲜温热的培养基中加入 BrdU,直至最终浓度为 0.03 mg/mL。搁置在一边。
  2. 通过离心分离从试管中采集约 5000 万个细胞,并吸干上清液。
  3. 将 2 ml 含 BrdU 的培养基添加至细胞沉淀物中,涡旋振荡后在 37°C 下孵育 30 分钟。
  4. 通过离心分离使细胞成团并吸干培养基。
  5. 将 2 ml 冷却的 70% 乙醇添加至细胞沉淀物中并且混合均匀。
  6. 室温下固定细胞 5 分钟。
  7. 加入 2–3 ml PBS,并通过离心分离润洗三次。
  8. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
  9. 加入 2–3 ml PBS 后通过离心分离润洗两次。
  10. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意:对于单克隆抗体,使用同型匹配的对照组;对于多克隆抗体,使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 分装 0.5–1 x 106 细胞到每个测定管中(根据容量)。
  2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管,随后通过离心分离润洗。重复操作。
  3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
  4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
  5. 向测试管加入适当稀释度的非偶联的一抗(参阅抗体数据表了解合适的稀释度)。
  6. 在室温下孵育一小时。
  7. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  8. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞,并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
  9. 在室温孵育 30 分钟。
  10. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞,并用流式细胞分析仪进行分析;或者继续步骤 D1 进行 DNA 染色。

D. 可选的 DNA 染色

  1. 在 0.5 ml DNA 染料中重悬细胞(如 DRAQ5® #4084)。
  2. 在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。

发布​于 2009 年 12 月 

实验步骤编号:30

特异性/敏感性

BrdU (Bu20a) Mouse mAb 可检测掺入单链 DNA 的 BrdU。DNA 必须经过变性,才能让表位暴露并且能让抗体识别到。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用与 BSA 结合的 BrdU 使动物免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

卤化核苷酸如嘧啶类似物溴脱氧尿苷 (BrdU) 对活细胞和组织中新生的DNA进行标记是有用的。BrdU 可代替胸苷掺入复制到 DNA 中,随后使用特异性单克隆抗体对 BrdU 进行免疫检测,以在细胞周期 S 期中对细胞进行标记。在利用溴脱氧尿苷对细胞或组织进行脉冲标记后,BrdU (Bu20a) Mouse mAb 可用于检测掺入单链 DNA 的 BrdU。请查看我们的详细流程以便了解与各种免疫检测应用的标记程序和双链 DNA 变性有关的信息 (1-4)。

  1. Darzynkiewicz, Z. and Juan, G. (2001) Curr Protoc Cytom Chapter 7, Unit 7.7.
  2. Leif, R.C. et al. (2004) Cytometry A 58, 45-52.
  3. Staszkiewicz, J. et al. (2009) Biochem Biophys Res Commun 378, 539-44.
  4. Rothaeusler, K. and Baumgarth, N. (2007) Curr Protoc Cytom Chapter 7, Unit7.31.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。

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