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58169
β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb

β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb #58169

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R 内源性 45 Rabbit IgG2a
蛋白质印迹法

使用 β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb 对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。

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IF-IC

使用 β-Actin (E4D9X) Mouse mAb(绿色)和 PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501(红色)对 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。

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流式细胞术

以浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415(虚线)作为对照,使用 β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb(实线)对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L),F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、 1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗说明书或产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测,蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个便利的试剂盒中提供:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液: (#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉 的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜和纸:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞(6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl)。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 取 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,5 µl/泳道)上样以验证电转移与生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:以下体积数适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II.一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody(#7076,按 1:2000的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody(#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育并伴有轻轻摇晃,在室温下孵育 1 小时,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

蛋白质印迹法再标记实验步骤

在样品数量有限时,在现有的膜上反复单独检测多种蛋白进行免疫印迹分析来说是一种非常方便的方法。应注意的是,为了获得最好的结果,始终建议您进行新的印记实验以进行分析。重新检测是一种比较有效的方法,但在每一次重新检测印迹时,背景信号可能会增强。此外,建议您在进行重新检测前确认一抗复合体已被清除,以便与新抗体结合而产生的信号不是第一次免疫印迹实验的残余信号。这可通过再次将印迹暴露于 ECL 试剂并确保在添加下一个一抗前无信号来确认。

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 洗涤缓冲液: Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) (#9997)
  2. 洗脱缓冲液:要制备 100 ml,可将 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml 、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巯基乙醇混合。使用去离子化 H20 补足至 100 ml。仅在使用前制备新鲜的缓冲液。

B. 实验步骤

  1. 胶片下曝光后,将膜置于 TBST 中清洗四次,每次 5 分钟。在膜未干燥的情况下才可获得最佳结果。
  2. 在 50°C 下,在膜再生液中将膜孵育 30 分钟,同时轻轻晃动。
  3. 在 TBST 中将膜清洗六次,每次 5 分钟。
  4. (可选)为了确保已清除原始信号,用 5 ml TBST 将膜清洗两次,每次 10 分钟。将膜与 LumiGLO® 在室温下孵育 1 分钟,同时轻轻搅动。将膜上多余的显影液沥干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射线胶片。
  5. 再次在 TBST 中将膜清洗四次,每次 5 分钟。
  6. 膜现在可以再次使用了。根据免疫印迹分析实验步骤中的“膜封闭和抗体孵育”步骤开始检测。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 6 月

实验步骤编号:19

免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,然后在细胞上覆盖一层 2-3mm 的用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透化步骤:用冰预冷的 100% 甲醇溶液将细胞覆盖(用足够的溶液完全覆盖 3–5 mm 深,并且保持湿润),在 –20°C 下甲醇中孵育 10 分钟,同时使用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按步骤 6 使用 1X PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:146

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛(无甲醇)
  3. 100% 甲醇
  4. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。
  5. 建议使用抗兔二抗:

B. 固定

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释一抗(按照推荐的稀释比例在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光染料标记的二抗(按建议的稀释度在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。
  8. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色,那么继续进行可选的 DNA 染色(参见 E 部分)。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号:404

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:400
流式细胞术 1:50
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

β-Actin (E4D9Z) Mouse mAb 可检测总 β-肌动蛋白的内源水平。

物种反应性:

人,小鼠,大鼠

使用与人 β-肌动蛋白中 Ala7 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

作为一种普遍表达的真核蛋白,肌动蛋白是细胞骨架的一种主要组分。哺乳动物至少有 6 种已知的同工型。非肌肉 β- 和 γ- 肌动蛋白也称为细胞质肌动蛋白,主要在非肌肉细胞中表达,可控制细胞结构和运动 (1)。α-心肌和 α-骨骼肌肌动蛋白分别在心脏横纹肌和骨骼肌中表达;两种平滑肌肌动蛋白(α- 和 γ-肌动蛋白)主要见于血管平滑肌和肠道平滑肌。这些肌蛋白同工型可调节肌肉细胞收缩能力 (1)。肌动蛋白主要作为一种纤维聚合物纤丝状肌动蛋白而存在。在一些进程(如胞质分裂、内吞或应激)中,在细胞骨架重组信号的刺激下,丝切蛋白促进纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚合导致单体球状形式球型肌动蛋白的增加 (2)。Arp2/3 复合体可稳定纤丝状肌动蛋白片段,并促进新肌动蛋白丝的形成 (2)。研究表明,肌动蛋白在原发性乳腺癌中被过度磷酸化 (3)。研究也表明,已经在体外、心肌和骨骼肌中观察到凋亡条件下的肌动蛋白的剪切 (4-6)。被 caspase-3 剪切的肌动蛋白,会加速泛素/蛋白酶体依赖的肌肉蛋白水解 (6)。

  1. Herman, I.M. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5, 48-55.
  2. Condeelis, J. (2001) Trends Cell Biol. 11, 288-293.
  3. Lim, Y.P. et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10, 3980-3987.
  4. Kayalar, C. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 2234-2238.
  5. Communal, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 6252-6256.
  6. Du, J. et al. (2004) J. Clin. Invest. 113, 115-123.
Entrez-Gene Id
60
Swiss-Prot Acc.
P60709
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Alexa Fluor 是 Life Technologies 公司的注册商标。
DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。

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100 µl(10 次蛋白质印迹实验)

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盛夏路399号

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