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14617
ATP6V1B2 (D2F9R) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体

ATP6V1B2 (D2F9R) Rabbit mAb #14617

引用 (2)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - ATP6V1B2 (D2F9R) Rabbit mAb

使用 ATP6V1B2 (D2F9R) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。

购买 # 14617S
产品货号 规格 价格 库存
14617S
100 µl

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 55
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

特异性/敏感性

ATP6V1B2 (D2F9R) Rabbit mAb 可识别 ATP6V1B2 总蛋白的内源水平。该抗体不会与 ATP6V1B1 蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 ATP6V1B2 蛋白羧基末端附近残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

真核细胞含有称作液泡 H+-ATP 酶(V-ATP 酶)的 ATP 驱动型质子泵,这种质子泵使胞内区室酸化并且跨质膜转移质子 (1,2)。胞内 v-ATP 酶在内吞和胞内膜转运中发挥重要作用,而质膜 v-ATP 酶在尿酸化和骨吸收等多个过程发挥重要作用 (1,2)。液泡 ATP 酶是较大的异源多聚体蛋白复合体,在 V1 周围结构域或 V0 整合结构域存在组分蛋白 (2)。胞质 V1 结构域含有 A 和 B 催化性亚基的六聚物,以及 ATP 酶装配和 ATP 水解所需的多种其他蛋白质亚基。V0 v-ATP 酶整合结构域显示蛋白质转移酶活性,并且负责跨膜转运质子 (2)。研究显示,v-ATP 酶 ATP6V0c、ATP6V0d1、ATP6V1A、ATP6V1B2 和 ATP6V1D 与调节分子蛋白复合体相互作用,并且为溶酶体表面上氨基酸诱导的 mTORC1 激活所必需 (3)。

人类中找到 B 亚基的两个同工型:ATP6V1B1 和 ATP6V1B2。ATP6V1B1 蛋白主要在肾中表达,相应基因中的突变会引起与进展性耳聋相关的某种形式的肾小管性酸中毒(4,5)。ATP6V1B2 蛋白显示更宽的表达范围,并定位于肾、脑、胰和其他组织 (4)。

  1. Marshansky, V. and Futai, M. (2008) Curr Opin Cell Biol 20, 415-26.
  2. Jefferies, K.C. et al. (2008) Arch Biochem Biophys 476, 33-42.
  3. Zoncu, R. et al. (2011) Science 334, 678-83.
  4. van Hille, B. et al. (1994) Biochem J 303 ( Pt 1), 191-8.
  5. Karet, F.E. et al. (1999) Nat Genet 21, 84-90.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
Tween 是 ICI Americas, Inc. 的注册商标。

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