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94871
Adora2a/Adenosine Receptor A2a (E5I8X) XP® Rabbit mAb (Rodent Specific)
一抗

Adora2a/Adenosine Receptor A2a (E5I8X) XP® Rabbit mAb (Rodent Specific) #94871

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
M R 内源性 兔 IgG
IHC-P(石蜡)

使用 Adora2a/ 腺苷受体 A2a (E5I8X) XP® 兔单克隆抗体 (特定啮齿动物) 对石蜡包埋的小鼠纹状体(左上图,阳性)和以下其他小鼠组织(阴性)进行免疫组织化学分析:肾脏(顶部中间)、肝脏(右上图)、前列腺(左下图)、小肠(底部中间)和胃(右下图)组织。

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IHC-P(石蜡)

以浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 #3900(右图)作为对照,使用 Adora2a/ 腺苷受体 A2a (E5I8X) XP® 兔单克隆抗体 (特定啮齿动物)(左图)对石蜡包埋的小鼠纹状体进行免疫组织化学分析。

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IF-F

使用 Adora2a/Adenosine Receptor A2a (E5I8X) 兔单克隆抗体 (特定啮齿动物)(绿色)和 GFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体 (Alexa Fluor® 647 偶联物) #3657(红色)对大鼠纹状体进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色 = DAPI #4083(DNA 荧光染料)。

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免疫组织化学(石蜡)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液:要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml,添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备 4 mL of dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐:将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2016 年 3 月

实验步骤编号:283

免疫荧光法(冰冻)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液:(1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS)并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗:

    注意:首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时,用滴定法检测抗体,以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 -冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,请立刻按下列步骤固定:
    1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2016 年 7 月

实验步骤编号:151

应用 稀释度
免疫组织化学(石蜡) 1:400
免疫荧光法(冰冻) 1:50
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

Adora2a/ 腺苷受体 A2a (E5I8X) XP® 兔单克隆抗体 (特定啮齿动物) 可检测啮齿动物 A2AR 总蛋白的内源水平。该抗体不会与人源 A2AR 蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

小鼠, 大鼠

使用与小鼠 A2AR 蛋白中 Ala401 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

腺苷受体 A2a (A2AR) 是一种 G 蛋白偶联受体 (GPCR)。作为嘌呤能腺苷受体(A1、A2 和 A3)的一员,A2AR 会在结合腺苷时激活典型的 G 蛋白信号转导通路 (1)。腺苷存在于所有细胞和胞外液中。在生理和病理状态下,会通过 A2AR 调动腺苷信号转导。例如,腺苷通过 A2AR 调节神经元功能,起到微调神经元功能的作用 (2)。在某种程度上,A2AR 与多巴胺受体(D1 和 D3)和代谢型谷氨酸受体 (mGluR5) 等其他 GPCRs 形成功能性异二聚体的能力会调节 A2AR 功能 (3)。在脑中,A2AR 在基底神经节中富集,表明 A2AR 可能是帕金森病、药物成瘾和精神疾病等神经退行性疾病的一个潜在药物靶标 (4)。在脑外,A2AR 是维持免疫抑制性肿瘤微环境的一种免疫检查点分子,免疫抑制性肿瘤微环境是一个显示出腺苷水平相对升高的环境 (5, 6)。

  1. Le, F. et al. (1996) Biochem Biophys Res Commun 223, 461-7.
  2. Sulli, G. et al. (2018) Trends Pharmacol Sci 39, 812-27.
  3. Verzijl, D. and Ijzerman, A.P. (2011) Purinergic Signal 7, 171-92.
  4. Bogenpohl, J.W. et al. (2012) J Comp Neurol 520, 570-89.
  5. Menzel, S. et al. (2018) Front Pharmacol 9, 266.
  6. Leone, R.D. et al. (2015) Comput Struct Biotechnol J 13, 265-72.
Entrez-Gene Id
11540
Swiss-Prot Acc.
Q60613
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
SignalStain 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Alexa Fluor 是 Life Technologies 公司的注册商标。

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