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51660
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
一抗

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

引用 (1)

使用 1 μg 小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 或 10 μl Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 进行 DNA 免疫沉淀。使用 mouse Aqp2 exon 1 primers、SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers #74803、mouse Lamc3 exon 1 primers 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量(等于 1)的信号进行表述。

使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb(绿色)和 DYKDDDDK Tag Antibody #2368(红色),对转染表达带有 DDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD) 载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。正如预期的一样,表达 TET1-CD(红色)的 293T 细胞出现 5-羟甲基胞嘧啶(绿色)水平升高。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过斑点印迹实验进行确定。专门使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC),通过 PCR 产生一个 387 碱基对 DNA 片段的相同序列。单独 DNA 片段被转移到尼龙膜上成为印迹,经紫外线交联并使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 进行检测。上小图显示抗体仅结合含 5-hmC 的 DNA 片段,而下小图则显示用亚甲蓝染色的膜。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶(5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC)的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如图表所示,该抗体仅结合含 5-hmC 的寡核苷酸。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 DNA 免疫沉淀进行确定。对用小鼠胚胎干细胞制备且加入含有未甲基化胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 或 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 的 DNA 的基因组 DNA 进行 DNA 免疫沉淀。使用与内标的对照 DNA 序列特异的引物,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量(等于 1)的信号进行表述。

购买 # 51660S
产品货号 规格 价格 库存
51660S
100 µl

支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 小鼠 IgG1

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:400
DNA 点印迹 1:1000
甲基化 DNA 免疫沉淀 1:50

存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:利用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

母液:

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 要制备 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中,混合均匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 乙醇,70% 溶液,去离子化。
  3. 1.5 M 盐酸
  4. 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 Normal Goat Serum (#5425))和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS/1% BSA/ 0.3% Triton™X-100):为配制 10 ml,将30 µl Triton™ X-100 和0.5mL 20X PBS 添加至 9.5mL dH2O。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  6. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗:

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干培养基后用冷却的 70% 乙醇完全浸没细胞。
  2. 室温下固定细胞 5 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
  5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次,每次 5 分钟。
  6. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2015 年 12 月 

实验步骤编号:865

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液: 3.0 M NaCl,0.3 M 柠檬酸钠,pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液: 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 2X DNA 变性缓冲液: 200mM NaOH,20mM EDTA。
  4. 无核酸酶的水: (#12931)
  5. 印迹膜:本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST): (#9997) 为配制 1 L 1X TBST:将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
  8. 脱脂奶粉: ( #9999)
  9. 封闭缓冲液: 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;对于 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;对于 20 ml,将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗:抗兔 (#7074);抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注:本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪,将片段化、纯化的基因组 DNA(滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型,抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前:
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA,并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。

可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳,分析 DNA 片段大小。

• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空,使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液,并在95° C 孵育 10 分钟,使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液,并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl,DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液,添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中,建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品,浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中,留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后,每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗(按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂)在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜,同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗(#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测(D 部分)。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®(0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水)或 10 ml SignalFire™ #6883(5 ml 试剂 A,5 ml 试剂 B)在室温孵育1 分钟,同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注:由于检测反应的动力学,信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

发布​于 2015 年 11 月 

实验步骤编号:804

SimpleDIP Hydroxymethylated DNA IP (hMeDIP) 实验步骤

所需的试剂

包括的试剂

编号 名称
31482 SimpleDIP Cell Lysis Buffer
49291 SimpleDIP DNA IP Buffer (10X)
7009 ChIP Elution Buffer (2X)
74252 TE Buffer
89173 3M Sodium Acetate, pH 5.2
9006 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads
10007 DNA Binding Buffer
10008 DNA Wash Buffer(使用前添加 4x 量的乙醇)
10009 DNA Elution Buffer
10010 DNA Purification Columns
10012 Proteinase K
7013 RNase A
51660 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
98528 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated)
86179 SimpleDIP Hydroxymethyl Control Spike-In DNA
20906 SimpleDIP Hydroxymethyl Control Primers

未提供的试剂

编号 名称
7017 / 14654 Magnetic Separation Rack
9872 Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile)
12931 Nuclease-free water
- Phenol/Choloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1) Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
- Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1)
- 乙醇 (96-100%)
- Trypsin
- Taq DNA polymerase
- dNTP mix
- Real-Time PCR SYBR Green Reaction Mix

第一部分 基因组 DNA 提取

开始之前,

  • 每次实验刺激或处理 500 万个细胞。这种细胞数量将产生大约 30 µg DNA(30 次免疫沉淀)。
  • 取 SimpleDIP Cell Lysis Buffer 放在 37℃ 水浴中加热,并确保 SDS 已溶解。
使用的细胞数量 大约产量
1 百万 6 µg
500 万 30 µg
1000 万 60 µg
    1. 对于悬浮细胞,使用血细胞计数器对细胞进行计数。

    2. 对于黏附细胞,去除培养基并用 10 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞,以完全去除培养皿中的洗液。加入 2 ml 胰蛋白酶来去除平板上的细胞。细胞完全分离后,加入 8 ml 含血清的培养基来中和胰蛋白酶,充分混合。使用血细胞计数器对细胞进行计数。

  1. 将 500 万个细胞转移到 15 ml 锥形试管中,并在 4℃ 下用台式离心机以 250 x g 离心分离 5 分钟。沉淀物用 10 ml 冰冷的 1x PBS 洗涤两次。每次洗涤后,重复离心。
  2. 在 500 µl SimpleDIP Cell Lysis Buffer 中重悬在步骤 2 中制备的细胞沉淀物。
  3. 将细胞和缓冲液转移到 1.5 ml 微量离心管中。添加 2 µl Proteinase K 到试管中,并在 55°C 下振荡孵育过夜(12-18 小时)。
  4. 添加 500 µl 苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1),并涡旋 30 秒钟来充分混合。
  5. 使用微量离心机以 10,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟来分层。小心将顶层液体转移到新试管中。
  6. 添加 500 µl 苯酚/氯仿/异戊醇 (24:1) 到物质中,并涡旋 30 秒钟来充分混合。
  7. 使用微量离心机以 10,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟来分层。小心将顶层液体转移到新试管中。
  8. 依次添加 50 µl 3M 乙酸钠, pH 5.2 和在 -20°C 下冷冻的 1.0 ml 100% 乙醇。在 -20°C 下孵育过夜或在 -80°C 下孵育 1 小时来使 DNA 沉淀。
  9. 用微量离心机以 10,000 x g 的离心力离心分离 5 分钟来使 DNA 沉淀。
  10. 小心地去除上清液,沉淀物用在 -20°C 下冷冻的 70% 乙醇洗涤。移出上清液,并风干或真空干燥沉淀物。
  11. 在 500 µl TE Buffer 中重悬沉淀物,并添加 2 µl RNase A。在 37°C 下孵育 30 分钟。
  12. 重复步骤 5-11,随后在 200 µl TE Buffer 中重悬沉淀物。

第二部分基因组 DNA 剪切和定量

  1. 在中等设置下,按 5 个脉冲对基因组 DNA(在第 一 部分的步骤 13 中制备)进行超声处理,每次 15 秒钟,每个脉冲间隔期间试管保存在冰上 30 秒钟。

    • 使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis VIRSONIC 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (The VirTis Company, Gardiner, NY) 以 5 组 15 秒脉冲将小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 破碎成 500 bp 的小片段。

    • 请参阅附件 A 了解进一步优化的超声处理条件。

  2. 取 5 μl 在步骤 1 中制备的基因组 DNA,使用 100 bp DNA 标记物的 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来确定 DNA 片段大小。DNA 应剪切成约 100-500 bp 的长度。
  3. 要确定 DNA 浓度,将 2μl 在步骤 1 中制备的基因组 DNA 转移到 98 μl TE Buffer 中,以获得 50 倍稀释度并读取 OD260。DNA 浓度(以 μg/ml 计)为 OD260 x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 150 µg/ml 之间。

第三部分DNA 免疫沉淀

注意:仅在单链 DNA 环境下,5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 才能结合羟甲基化基因组 DNA。但下一代测序分析库制备试剂盒需要双链 DNA 来执行接头蛋白连接步骤,并且对 hMeDIP 实验步骤中的热变性 DNA 不具有高效率。因此,在设置 DNA 免疫沉淀之前,用户必须执行制造商 DNA 文库制备实验步骤中建议的接头蛋白连接步骤。用户随后应使用 1 ug 接头蛋白连接的 DNA 来进行 DNA 免疫沉淀。

开始之前,

  • 取 10X SimpleDIP IP Buffer 放在 37°C 的水浴中加热,并确保没有沉淀物。
  1. 在一根试管中,根据所需的免疫沉淀数制备足够的免疫沉淀混合物(参见下表。)在确定免疫沉淀的次数时,用户应纳入阴性对照 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 样品以及 1 次额外的免疫沉淀(10% 输入)。将混合物置于冰上。
试剂 每次免疫沉淀/输入的数量
10x SimpleDIP DNA IP Buffer 50 μl
经超声处理的基因组 DNA 1 µg
SimpleDIP Hydroxymethyl Control Spike-In DNA(可选) 1 µl
dH2O 最高终体积为 500 µl
  1. 取出 50 μl 稀释的 DNA 样品并转移到微量离心管中。这是 10% 输入样品。
  2. 对于每一次免疫沉淀,将 500 µl 免疫沉淀混合物转移到 1.5 ml 微量离心管中,每根试管在 95°C 下加热 10 分钟以使 DNA 变性。请确保也加热 10% 输入。样品迅速放在冰水浴中 5 分钟。

    • 之后,必须让所有缓冲液保持冷却,并将样品放在冰上,以维持单链 DNA。现在,输入样本可保存在 -20°C 下备用。

  3. 添加 10 µl 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660 或 10 µl Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 到相应免疫沉淀样品中。样品在 4°C 下旋转孵育过夜。
  4. 轻轻涡旋来重悬 ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即添加 20 µl ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006 到每份样品中,并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。继续进行第四部分。

第四部分清洗并洗脱免疫沉淀的 DNA

  • 开始前,制备并在冰上冷却每次免疫沉淀所需的:
  • 4 ml 1X SimpleDIP DNA-IP Buffer(400 µl 10X SimpleDIP IP Buffer + 3.6 ml 水)
  • 取 2X ChIP Elution Buffer 放在 37°C 水浴中加热,并确保 SDS 在溶解状态中。
  • 配制每次免疫沉淀所需的 150 µl 1X ChIP Elution Buffer(75 µl 2x ChIP Elution Buffer + 75 µl 水)和 10% 输入样品。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  1. 将试管放在磁分离架上,让 protein G magnetic beads(在第 三 部分的步骤 5 中制备)沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,随后小心地去除上清液。
  2. 添加 1 ml 1X SimpleDIP DNA IP buffer 到微珠中,并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。
  3. 将试管放在 磁分离架 上,让 protein G magnetic beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清,随后小心地去除上清液。
  4. 再重复步骤 2 和 3 三次,确保共洗涤 4 次。
  5. 添加 150 µl 1X ChIP Elution Buffer 到每份免疫沉淀样品中,包括 10% 输入 样品试管。将输入样品保存在室温下,直至步骤 9。
  6. 在 65°C 下,通过轻轻涡旋 (1,200 rpm) 洗脱抗体/蛋白 G 微珠上的 DNA,持续 30 分钟。对于这个步骤,热混合仪效果最佳。或者,在室温下通过旋转进行洗脱,但可能洗脱不完全。
  7. 将试管置于 Magnetic Separation Rack 上,让 Protein G Magnetic Beads 沉淀,然后等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清。
  8. 小心地将洗脱的 DNA 转移到新试管中。
  9. 立即进行第五部分。或者,将样品保存在 -20°C 下。但为了避免形成沉淀物,请确保在添加 DNA Binding Buffer 之前,将样品温热到室温(第 五 部分,步骤 1)。

第五部分 使用离心柱进行 DNA 纯化

开始之前,

  • 使用前添加 10 ml 乙醇 (96-100%) 到 DNA Wash Buffer 中。在第一组 DNA 纯化之前,这个步骤仅需进行一次。
  • 取一根 DNA 离心柱/收集管用于第四部分得到的每份 DNA 样品。
  1. 添加 750 µl DNA Binding Buffer 到每份 DNA 样品中,稍微涡旋。

    • 对于每 1 体积样品,应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。

  2. 转移步骤 1 中制备的每份样品 (450 μl) 到收集管中的 DNA Purification Column 上。
  3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 将在步骤 1 中制备的 450 μl 剩余样品转移到收集管的离心柱里,并重复步骤 3 和 4。
  6. 向收集管的离心柱添加 750 μl DNA Wash Buffer。
  7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  8. 从收集管中取出 DNA 离心柱,并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 添加 50 μl DNA Elution Buffer 到每根 DNA 离心柱上,并放在 1.5 ml 干净的微量离心管中。
  12. 用微量离心机以 18,500 x g 的离心力离心分离 30 秒,以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。样品可在 -20℃ 下贮存。

第六部分用 PCR 定量 DNA

建议

  • 使用带滤嘴的移液管吸头来最大限度降低污染风险。
  • 试剂盒中包含的对照引物专门针对 SimpleDIP Hydroxymethyl Control Spike-In DNA #86179,可用于标准 PCR 或实时定量 PCR。
  • 建议用热启动 Taq 聚合酶来最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物:
引物长度 24 个核苷酸
最佳 Tm 60℃
最佳 GC 50%
扩增产物大小 150 至 200 bp(对于标准 PCR);80 至 160 bp(对于实时定量 PCR)

标准 PCR 方法:

  1. 根据待分析样品的数量,标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 10% 输入 样品和阴性对照 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 以及一根不含 DNA 且用于观察 DNA 污染的试管。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物,配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
不含核酸酶的 dH2O 12.5 μl
10X PCR 缓冲液 2.0 μl
4mM dNTP 混合物 1.0 μl
5 µM 引物 2.0 μl
Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序:
a. 初始变性 95℃ 5 分钟
b. 变性 95℃ 30 秒
c. 复性 62℃ 30 秒
d. 延伸 72℃ 30 秒
e. 重复步骤 b-d,共循环 34 次。
f. 终末延伸 72℃ 5 分钟
  1. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物,使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳,以进行分析。对于加入到 #20906 的阳性对照,PCR 产物的预期大小为 120 bp。

实时荧光定量 PCR 方法:

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应包括阴性对照 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528、一支不含 DNA 以监控有无污染的小管或一个孔,以及梯度稀释的 10% 输入 基因组 DNA(未稀释、1:5、1:25、1:125),以生成标准曲线并确定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 6 μl
5 µM 引物 2 μl
SYBR Green Reaction Mix 10 μl
  1. 开始以下 PCR 反应程序:
a. 初始变性 95℃ 3 分钟
b. 变性 95℃ 15 秒
c. 复性 65°C 60 秒
d. 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。
  1. 使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用输入样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为总输入样品染色质的百分比。

    输入百分比 = 10% x 2(C[T] 10% 输入样品 - C[T] 免疫沉淀样品)
    C[T] = CT = PCR 反应的循环阈值

附件 A. 超声处理条件的优化

将基因组 DNA 剪切为 150-500 bp 长度的最佳条件可能取决于细胞类型和细胞数量以及所使用的超声仪类型。以下实验步骤用于确定特定细胞类型和细胞浓度的最佳超声处理条件。

  1. 如第 I 部分的步骤 1-13 所述,用 500 万个细胞制备基因组 DNA。
  2. 在中等设置下,以 10 个脉冲进行超声处理,每次 15 秒,每个脉冲间放在冰上 30 秒。每 2 个脉冲后,取 5 µl 样品。通过对含 100 bp DNA 标记物的 1% 琼脂糖凝胶进行电泳来确定 DNA 片段大小。
  3. 观察哪种超声处理条件能产生 150-500  所需bp范围内的 DNA。这些条件随后可在第二部分的步骤 1 中使用,从而取代建议的实验步骤。
500 万个小鼠 ES 细胞的基因组 DNA

使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 0、2、4、6、8 和 10 组 15 秒脉冲对 500 万个小鼠 ES 细胞的基因组 DNA 进行碎裂。DNA 样品和 100 bp 标记物在1% 琼脂糖凝胶电泳中分离并用溴化乙锭染色。

附件 B. 疑难指南

实验步骤 问题 原因和解决方案
实验步骤 问题 原因和解决方案
基因组 DNA 提取 DNA 碎片的浓度过低。 未加入足够细胞来进行基因组 DNA 提取。在进行基因组 DNA 提取前,用一个单独平板上的细胞进行计数,以确保准确计数。基因组 DNA 提取实验步骤适合每 500 ml SimpleDIP 细胞裂解缓冲液使用多达 1000 万个细胞。添加超过 1000 万个细胞可能抑制细胞裂解,同时降低 DNA 浓度。
基因组 DNA 剪切和定量 OD260/280 比值低于 1.8(DNA 不纯)。 在苯酚和/或氯仿提取过程中,会残留苯酚和/或盐。在提取过程中,留下少量上层提取物,以确保苯酚或盐不会无意中随含 DNA 的上清液一同转移。
DNA 片段的大小不正确。 超声处理功率或脉冲次数不足以正常剪切 DNA。参阅附件 A 了解 DNA 剪切优化实验步骤。
DNA 免疫沉淀 我能否改变免疫沉淀中使用的抗体或 DNA 数量? 已针对 1 µg 抗体和 1 µg 基因组 DNA 对试剂盒进行了优化。添加较少抗体或 DNA 可能会减缓羟甲基化 DNA 的恢复,而添加额外抗体或 DNA 可能会降低免疫沉淀的特异性并产生假阳性富集。
能否使用试剂盒中的其他抗体? 实验步骤已经过验证和优化,适用于试剂盒中包含的抗体。根据该试剂盒中提供的实验步骤使用其他抗体进行实验可能不会产生最佳效果。
用 PCR 定量 DNA 羟甲基化 DNA 很少或没有出现富集 每次进行免疫沉淀时,应使用 1 µg 抗体和 1 µg 基因组 DNA。减量任何一种都可能会减缓羟甲基化 DNA 的恢复并减弱信号。
该抗体仅结合单链 DNA,因此请确保变性后的所有实验步骤都在冰上进行,以防复性。
DNA 未完全从微珠上洗脱下来可能会减缓羟甲基化 DNA 的恢复并减弱信号。将 DNA 从蛋白 G 微珠上洗脱下来时,最好在 65°C 下通过频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。
IgG 对照免疫沉淀中的背景较高。 每次进行免疫沉淀时,应使用 1 µg 抗体和 1 µg 基因组 DNA。使用额外抗体或 DNA 可能会增加非特异性相互作用的次数,从而产生更高的背景。添加较少的 DNA 会使 IgG PCR 反应中的信号较您的输入更高。
如果进行凝胶 PCR,则按比例减少循环次数,以确保您在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物。否则,无法准确测量初步 DNA 的数量差异。或者,通过实时 PCR 对您的免疫沉淀物进行定量分析。
DIP-测序 该试剂盒可否用于测序? 可以。但下一代测序分析库制备试剂盒需要双链 DNA 来执行接头蛋白连接步骤,并且对 MeDIP 实验步骤中的富集热变性 DNA 不具有高效率。因此,在第三部分设置 DNA 免疫沉淀之前,用户必须执行制造商 DNA 文库制备实验步骤中建议的接头蛋白连接步骤。用户随后应使用 1 µg 接头蛋白连接的 DNA 来进行 DNA 免疫沉淀。
保存 在实验步骤完成之前何时可以暂时终止实验步骤并保存相关材料? 在完成第一部分的步骤 2 后,细胞沉淀物可以急速冷冻并保存在 -80°C 下。
在完成第一部分的步骤 9 或步骤 13 后,基因组 DNA 可保存在 -20°C 下。
在完成第二部分的步骤 3 后,剪切的 DNA 可保存在 -20°C 下。
在完成第四部分的步骤 9 后,DNA 免疫沉淀物可保存在 -20°C 下过夜。但在第五部分的步骤 1 中,为了避免形成沉淀物,请确保在添加 DNA Binding Reagent A 之前,将样品加热到室温。
在完成第五部分的步骤 13 后,免疫沉淀的基因组 DNA 可保存在 -20°C 下。但在用于 PCR 之前,请确保将冷冻物质加热到 37°C 10 分钟,因为热处理会释放所有在保存过程中与试管结合的 DNA。

发布​于 2015 年 11 月 

实验步骤编号:844

特异性/敏感性

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 可识别内源水平的 5-hmC ;但许多细胞和组织包含低水平的 5-hmC,可能低于该抗体检测限。该抗体现已使用 ELISA、斑点印迹和 MeDIP 测定法进行了验证,并且表明对 5-hmC 有高特异性。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用 5-羟甲基胞苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰,对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物,并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为,5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而,后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外,TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC),二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除,从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系,并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。

TET 蛋白介导的胞嘧啶羟甲基化最初在小鼠脑和胚胎干细胞中得到证实 (5, 8)。自此已经在许多组织中发现这种修饰作用,而脑中这种水平最高 (9)。尽管 5-fC 和 5-caC 似乎是短期中间体种类,但越来越多的证据显示, 5-hmC 是具有各种独特功能的不同表观遗传标记物 (10,11)。修饰的碱基本身在体内较稳定并且会与 MeCP2 等各种读取蛋白相互作用 (11,12)。在大脑发育期间,5-hmC 的总体水平升高,并且 5-hmC 在启动子区域和稳定增强子中富集。另外,在 5-hmC 水平和组蛋白 H3K9 水平与 H3K27 三甲基化水平之间存在反相关性,表明 5-hmC 在基因激活中发挥作用 (12)。在多种癌症(包括髓样白血病和黑色素瘤)中,已经报道 5-hmC 的含量较低 (13,14)。

  1. Hermann, A. et al. (2004) Cell Mol Life Sci 61, 2571-87.
  2. Turek-Plewa, J. and Jagodziński, P.P. (2005) Cell Mol Biol Lett 10, 631-47.
  3. Okano, M. et al. (1999) Cell 99, 247-57.
  4. Li, E. et al. (1992) Cell 69, 915-26.
  5. Tahiliani, M. et al. (2009) Science 324, 930-5.
  6. He, Y.F. et al. (2011) Science 333, 1303-7.
  7. Ito, S. et al. (2011) Science 333, 1300-3.
  8. Kriaucionis, S. and Heintz, N. (2009) Science 324, 929-30.
  9. Globisch, D. et al. (2010) PLoS One 5, e15367.
  10. Gao, Y. et al. (2013) Cell Stem Cell 12, 453-69.
  11. Mellén, M. et al. (2012) Cell 151, 1417-30.
  12. Wen, L. et al. (2014) Genome Biol 15, R49.
  13. Delhommeau, F. et al. (2009) N Engl J Med 360, 2289-301.
  14. Lian, C.G. et al. (2012) Cell 150, 1135-46.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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