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5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb

5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb #74178

IF-IC

使用 5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb(绿色)和 DYKDDDDK Tag (9A3) Mouse mAb #8146 (红色),对使用构建体转染的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析,这种构建体表达加 DDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD)。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。正如预期所示,表达 TET1-CD 的 293T 细胞(红色)显示 5-甲酰基胞嘧啶水平增加(绿色)。

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点印迹-DNA

通过点印迹法确定 5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb 的特异性。专门使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC),通过 PCR 产生一个 387 碱基对 DNA 片段的相同序列。将相应的 DNA 片段印迹到尼龙膜上,UV 交联并用 5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb 探测。上半小图显示仅与含有 5-fC 的 DNA 片段结合的抗体,而下半小图显示用亚甲基蓝染色的膜。

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ELISA-DNA 寡聚物

通过 ELISA 确定 5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb 的特异性。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶(5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC)的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如该曲线中所示,该抗体仅与含有 5-fC 的寡聚物结合。

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免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:利用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

母液:

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:利用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 吸去培养基,用冰冷的 70% 乙醇完全覆盖细胞。
  2. 室温下固定细胞 5 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
  5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次,每次 5 分钟。
  6. 继续进行免疫染色C部分.

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2015 年 12 月 

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液: 3.0 M NaCl,0.3 M 柠檬酸钠,pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液: 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 2X DNA 变性缓冲液: 200mM NaOH,20mM EDTA。
  4. 无核酸酶的水: (#12931)
  5. 印迹膜:本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST): (#9997) 为配制 1 L 1X TBST:将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
  8. 脱脂奶粉: ( #9999)
  9. 封闭缓冲液: 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;对于 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;对于 20 ml,将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗:抗兔 (#7074);抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注:本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪,将片段化、纯化的基因组 DNA(滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型,抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前:
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA,并且超声处理
基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。可以
通过含 100 bp DNA
标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳,分析 DNA 片段大小。• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空,使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液,并在95° C 孵育 10 分钟,使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液,并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl,DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液,添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中,建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品,浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中,留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后,每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗(按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂)在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜,同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗(#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测(D 部分)。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®(0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水)或 10 ml SignalFire™ #6883(5 ml 试剂 A,5 ml 试剂 B)在室温孵育1 分钟,同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注:由于检测反应的动力学,信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

发布​于 2015 年 11 月 

应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:200
DNA 点印迹 1:1000
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

5-Formylcytosine (5-fC) (D5D4K) Rabbit mAb 可通过 IF 检测过表达 TET1 催化结构域的细胞中的 5-fC,也可通过使用包含 5-fC 的双链 PCR 片段进行斑点印迹实验来检测 5-fC。许多细胞和组织的 5-fC 内源水平极低,并且可能会低于该抗体的检测范围。现已使用 ELISA 和斑点印迹法验证该抗体的特异性,结果表明对 5-fC 有高特异性。

物种反应性:

预期的所有物种

通过采用 5-甲酰基-2'-脱氧胞嘧啶免疫动物,产生单克隆抗体。

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰,对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物,并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为,5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而,后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外,TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC),二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除,从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系,并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。

TET 蛋白介导的胞嘧啶羟甲基化最初在小鼠脑和胚胎干细胞中得到证实 (5, 8)。自此已经在许多组织中发现这种修饰作用,而脑中这种水平最高 (9)。尽管 5-fC 和 5-caC 似乎是短期中间体种类,但越来越多的证据显示, 5-hmC 是具有各种独特功能的不同表观遗传标记物 (10,11)。修饰的碱基本身在体内稳定并且与各种效应分子(包括 MeCP2)相互作用 (11,12)。脑发育期间 5-hmC 的总体水平增加,并且 5-hmC 在启动子区和增强子处富集。另外,在 5-hmC 水平和组蛋白 H3K9 水平与 H3K27 三甲基化水平之间存在反相关性,表明 5-hmC 在基因激活中发挥作用 (12)。在多种癌症(包括髓样白血病和黑色素瘤)中,已经报道 5-hmC 的含量较低 (13,14)。

  1. Hermann, A. et al. (2004) Cell. Mol. Life Sci. 61, 2571-2587.
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  12. Wen, L. et al. (2014) Genome Biol 15, R49.
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  14. Lian, C.G. et al. (2012) Cell 150, 1135-46.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。

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