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51660
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
MeDIP 试剂盒与试剂

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

MeDIP

使用 SimpleDIP™ Hydroxymethylated DNA IP (hMeDIP) Kit # 95176 对 1 μg 小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 或 10 μl Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) #98528 进行 DNA 免疫沉淀。使用 mouse Aqp2 exon 1 primers、SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers #74803、mouse Lamc3 exon 1 primers 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量(等于 1)的信号进行表述。

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IF-IC

使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb(绿色)和 DYKDDDDK Tag Antibody #2368(红色),对转染表达带有 DDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD) 载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。正如预期的一样,表达 TET1-CD(红色)的 293T 细胞出现 5-羟甲基胞嘧啶(绿色)水平升高。

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点印迹-DNA

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过斑点印迹实验进行确定。专门使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC),通过 PCR 产生一个 387 碱基对 DNA 片段的相同序列。单独 DNA 片段被转移到尼龙膜上成为印迹,经紫外线交联并使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 进行检测。上小图显示抗体仅结合含 5-hmC 的 DNA 片段,而下小图则显示用亚甲蓝染色的膜。

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ELISA-DNA 寡聚物

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶(5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC)的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如图表所示,该抗体仅结合含 5-hmC 的寡核苷酸。

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MeDIP

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 DNA 免疫沉淀进行确定。对用小鼠胚胎干细胞制备且加入含有未甲基化胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 或 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 的 DNA 的基因组 DNA 进行 DNA 免疫沉淀。使用 SimpleDIP™ Hydroxymethylated DNA IP (hMeDIP) Kit #95176 进行免疫沉淀。使用与内标的对照 DNA 序列特异的引物,通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量(等于 1)的信号进行表述。

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应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:200
DNA 点印迹 1:1000
甲基化 DNA 免疫沉淀 1:50
存储:

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 可识别内源水平的 5-hmC ;但许多细胞和组织包含低水平的 5-hmC,可能低于该抗体检测限。该抗体现已使用 ELISA、斑点印迹和 MeDIP 测定法进行了验证,并且表明对 5-hmC 有高特异性。

物种反应性:

预期的所有物种

使用 5-羟甲基胞苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰,对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物,并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为,5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而,后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外,TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC),二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除,从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系,并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。

TET 蛋白介导的胞嘧啶羟甲基化最初在小鼠脑和胚胎干细胞中得到证实 (5, 8)。自此已经在许多组织中发现这种修饰作用,而脑中这种水平最高 (9)。尽管 5-fC 和 5-caC 似乎是短期中间体种类,但越来越多的证据显示, 5-hmC 是具有各种独特功能的不同表观遗传标记物 (10,11)。修饰的碱基本身在体内较稳定并且会与 MeCP2 等各种读取蛋白相互作用 (11,12)。在大脑发育期间,5-hmC 的总体水平升高,并且 5-hmC 在启动子区域和稳定增强子中富集。另外,在 5-hmC 水平和组蛋白 H3K9 水平与 H3K27 三甲基化水平之间存在反相关性,表明 5-hmC 在基因激活中发挥作用 (12)。在多种癌症(包括髓样白血病和黑色素瘤)中,已经报道 5-hmC 的含量较低 (13,14)。

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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SimpleDIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
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