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24547
PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit #24547

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图 1:使用 PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit 检测发现,Btk 蛋白在各种人或小鼠细胞中表达,但不存在于 MOLT-4 和 Jurkat 细胞系。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 Btk (D6T2C) Mouse mAb #56044 检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

图 2:Ramos 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit 检测的在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。未饥饿的 Ramos 细胞(1.0 x106 个细胞/ml)在采集后进行裂解。

购买 # 24547C
产品货号 规格 价格 库存
24547C
1 个试剂盒(96 次检测)

支持数据

反应性 H M

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
Btk Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Btk Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml 无色
STOP Solution 7002 11 ml 无色
Sealing Tape 2 ea
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml 淡黄色
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 10 ml

产品说明

PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,可检测内源水平的 Btk 蛋白。Btk rabbit mAb 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 Btk 蛋白。充分洗涤后,加入 Btk mouse detection mAb 来检测捕获的 Btk 蛋白。随后使用 Anti-mouse, HRP-linked antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与 Btk 蛋白的数量成比例。

试剂盒中的抗体为针对该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

实验步骤编号:204

特异性/敏感性

PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit 可检测人或小鼠细胞中内源水平的 Btk 蛋白,如图 1 所示。该试剂盒的敏感度如图 2 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

背景

Bruton 酪氨酸激酶 (Btk) 是细胞质酪氨酸激酶 Btk/Tec 家族的成员。与其他 Btk 家族成员一样,它含有一个 pleckstrin 同源性 (PH) 结构域以及 Src 同源性 SH3和 SH2 结构域。Btk 在 B 细胞发育中发挥重要作用 (1,2)。各种配体激活 B 细胞的同时,Btk 膜转位受到其 PH 结构域与磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸结合的介导 (3-5)。Btk 定位于细胞膜后具有活性并瞬间磷酸化两个酪氨酸残基 Tyr551 和 Tyr223激活环中的 Tyr551 位点被 Src 家族酪氨酸激酶转磷酸化导致在 SH3 结构域内的 Tyr223 位点的自磷酸化,这对 B 细胞的完全激活非常重要 (6,7)。PKCβ 通过磷酸化 Btk 的 Ser180 位点而负向调控 Btk 的激活,并导致了细胞膜招募能力降低、磷酸根转移和后续的激活8。PKC 抑制信号可能是 B 细胞受体信号转导阈值维持最佳 Btk 活性的重要决定因素 (8)。

  1. Khan, W.N. (2001) Immunol Res 23, 147-56.
  2. Lewis, C.M. et al. (2001) Curr Opin Immunol 13, 317-25.
  3. Salim, K. et al. (1996) EMBO J 15, 6241-50.
  4. Rameh, L.E. et al. (1997) J Biol Chem 272, 22059-66.
  5. Várnai, P. et al. (1999) J Biol Chem 274, 10983-9.
  6. Rawlings, D.J. et al. (1996) Science 271, 822-5.
  7. Park, H. et al. (1996) Immunity 4, 515-25.
  8. Kang, S.W. et al. (2001) EMBO J 20, 5692-702.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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