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7961
PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit #7961

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像库导航 1

图 1. 使用 PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit #7961 可在多种细胞系中检测到不同水平的 AMPKα 蛋白。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 AMPKα (D63G4) Rabbit mAb #5832 检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

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敏感性图像库导航 2

图 2. HeLa 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit #7961 检测的在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。HeLa 细胞(85% 融合度)在采集后进行裂解。

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产品包括 体积 溶液颜色
AMPKα Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
AMPKα Rabbit Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
HRP-Linked Streptavidin (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,可检测内源水平的 AMPKα 。AMPKα Rabbit mAb 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 AMPKα(磷酸和非磷酸形式)。充分洗涤后,加入生物素化 AMPKα Rabbit Detection mAb 来检测捕获的磷酸和非磷酸 AMPKα 蛋白。随后使用 HRP-linked streptavidin antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与总 AMPKα 的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

PathScan® Total AMPKα Sandwich ELISA Kit 可检测内源水平的 AMPKα 蛋白,如图 1 所示。该试剂盒的敏感度如图 2 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 仓鼠 , 猴

AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物中都高度保守,且在调节能量平衡方面发挥关键作用 (1)。AMPK 蛋白以一种异三聚体复合体的形式存在,由一个 α-催化亚基、一个 β-调节亚基和一个 γ-调节亚基组成,每个亚基被两到三个不同基因编码 (α1、2;β1、2;γ1、2、3) (2)。该激酶会被因细胞和环境压力引起AMP/ ATP 比值升高而激活,如热休克,缺氧和缺血 (1)。抑癌基因 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 一同将位于活化环里 Thr172 位点的 AMPKα 磷酸化,该位点的磷酸化是 AMPK 激酶活性所必需的 (3-5)。AMPKα 在 Thr258 位点和 Ser485 位点(对于 α1;α2 是 Ser491 位点)也被磷酸化。上游激酶以及这些磷酸化事件的生物学意义尚未被阐明 (6)。β1 亚基是通过豆蔻酰化和多位点磷酸化翻译后修饰的,这些位点包括 Ser24/25 位点、Ser96 位点、Ser101 位点、Ser108 位点和 Ser182 位点 (6,7)。β1 亚基 Ser108 位点的磷酸化似乎对 AMPK 酶活性是必要的,而 Ser24/25 位点和 Ser182 位点的磷酸化会影响 AMPK 定位 (7)。已确定了一些 AMPKγ 亚基的突变,其中大部分位于假定的 AMP/ ATP 结合位点(CBS 或Bateman域)。这些位点的突变导致 AMPK 活性降低,引起心脏或骨骼肌糖原积累 (1,2)。越来越多证据表明,AMPK 不仅调节脂肪酸和糖原的代谢,也通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路调节蛋白质合成和细胞生长,另外还通过 eNOS / nNOS 调节血流量 (1)。

  1. Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 3329-35.
  6. Woods, A. et al. (2003) J Biol Chem 278, 28434-42.
  7. Warden, S.M. et al. (2001) Biochem J 354, 275-83.
Entrez-Gene Id
5562 , 5563
Swiss-Prot Acc.
Q13131 , P54646
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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