对促销感兴趣? | 点击此处 >>
7322
PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit

PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit #7322

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像 1

图 1:使用 PathScan® Phospho-ALK (Tyr1604) Sandwich ELISA Kit #7324(右上图)可检测在使用磷酸酶抑制剂时裂解的 Karpas299 细胞中 NPM-ALK 的组成性磷酸化。相反,对于在未添加磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(非磷酸裂解物)中裂解的 Karpas299 细胞,仅检测到较低水平的磷酸-NPM-ALK 蛋白。但在非磷酸或磷酸裂解物中,使用 PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit #7322(左上图)检测到类似水平的 NPM-ALK 蛋白。在 450 nm 处的吸光度如顶部图所示,使用 Phospho-ALK (Tyr1604) Antibody #3341(右图)或 Total ALK Rabbit mAb #3337(左图)检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。细胞系来源:University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。

了解有关我们如何获得图像的详情
敏感图像 2

图 2:磷酸-和非磷酸-裂解物的蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。Karpas299 细胞在浓度为 106 个细胞/ml 时收集,并在添加或未添加磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中进行裂解。细胞系来源:University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。

了解有关我们如何获得图像的详情
特异性图像 3

图 3.对 ELISA 微孔捕获的蛋白进行蛋白质印迹分析证实了试剂盒的特异性。人 Karpas299 细胞裂解物在用 ALK 捕获抗体包被的微孔中进行孵育。洗涤后,捕获的蛋白在 SDS 凝胶上样缓冲液中溶解。使用 ALK 检测抗体对 Karpas299 细胞裂解物(泳道 1)和捕获蛋白(泳道 2)进行蛋白质印迹分析。捕获物质(泳道 2)中的一对不同条带对应 ALK 蛋白和 NPM-ALK 融合蛋白。细胞系来源:University of Cambridge 的 Abraham Karpas 博士。

了解有关我们如何获得图像的详情
产品包括 体积 溶液颜色
ALK Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
ALK Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅部分 A,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅部分 A,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

CST 的 PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能检测内源水平的总 ALK 和 NPM-ALK 融合蛋白。ALK rabbit capture antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 ALK 和 NPM-ALK 蛋白(磷酸和非磷酸形式)。充分洗涤后,加入 ALK mouse detection antibody 来检测捕获的 ALK 和 NPM-ALK 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与总 ALK 和 NPM-ALK 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

CST 的 PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit #7322 可检测内源水平的总 ALK 和 NPM-ALK 融合蛋白。在 ALK 或 NPM-ALK 被组成性磷酸化的 Karpas299 细胞中检测到较高水平的磷酸-ALK (Tyr1604) 蛋白和磷酸-NPM-ALK 融合蛋白(图 1)。在未添加磷酸酶抑制剂*的裂解缓冲液中裂解的 Karpas299 细胞中,未发现有高水平蛋白。使用 PathScan® Total ALK Sandwich ELISA Kit #7322 检测的 ALK 总蛋白(磷酸和非磷酸形式)水平保持不变(图 1)。对在 ALK Antibody 包被的微孔中捕获到的蛋白所进行的蛋白质印迹分析表明,两个条带对应 ALK 蛋白和 NPM-ALK 融合蛋白(图 3)。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

*磷酸酶抑制剂包括焦磷酸钠、β-甘油磷酸和 Na3VO4

物种反应性:

间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 是多效生长因子 (PTN) 的一种酪氨酸激酶受体,PTN 是与胚胎脑发育有关的生长因子 (1-3)。在表达 ALK 的细胞中,PTN 诱导 ALK 和下游效因子 IRS-1、Shc、PLCγ 和 PI3 激酶发生磷酸化 (1)。ALK 最初被发现是转位产生的一种核磷蛋白 (NPM)-ALK 融合蛋白 (4)。研究人员发现,NPM-ALK 融合蛋白是一种与间变性淋巴瘤相关的结构激活且会致癌的酪氨酸激酶 (4)。研究文献表明,NPM-ALK 激活 PLCγ 可能是有丝分裂活性的关键步骤,可能与间变性淋巴瘤的发病机理有关 (5)。

针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系的研究文献,描述了与 ALK 和棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4) 的不同的 ALK 致癌融合蛋白,并且在某些肺腺癌病例中存在相应融合转录蛋白。微管相关蛋白 EML4 的短氨基末端区域能融合到 ALK 的激酶结构域 (6-8)。

  1. Stoica, G.E. et al. (2001) J Biol Chem 276, 16772-9.
  2. Iwahara, T. et al. (1997) Oncogene 14, 439-49.
  3. Morris, S.W. et al. (1997) Oncogene 14, 2175-88.
  4. Morris, S.W. et al. (1994) Science 263, 1281-4.
  5. Bai, R.Y. et al. (1998) Mol Cell Biol 18, 6951-61.
  6. Rikova, K. et al. (2007) Cell 131, 1190-203.
  7. Takeuchi, K. et al. (2008) Clin Cancer Res 14, 6618-24.
  8. Soda, M. et al. (2007) Nature 448, 561-6.
Entrez-Gene Id
238
Swiss-Prot Acc.
Q9UM73
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

上游 / 下游

通路图

探索与本品相关的通路。

重要订购明细

客户订购明细:订购 5 个或更多试剂盒时,请联系我们了解处理时间和定价,联系方式为 sales@cellsignal.com

中国分公司 (PRC)

赛信通(上海)生物试剂有限公司

上海浦东新区

盛夏路 399 号

亚芯科技园 7 号楼

201210​

中国

电话:
+86-21-58356288
传真:
+86-21-58356116
电话:
4006-473287/GreatQ [免费电话]
电子邮件:
info@cst-c.com.cn
网址:
www.cst-c.com.cn

需要不同国家或地区的信息?请点击此处

如需获得有关本品的当地订购信息,请点击此处

Powered By OneLink