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7170
PathScan® Total Akt1 Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Total Akt1 Sandwich ELISA Kit #7170

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像库导航 1

图 1:NIH/3T3 细胞用不同浓度的 LY294002 处理会阻断 PDGF 刺激的的 Akt1在丝氨酸 473位点的磷酸化,可使用 PathScan Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA kit #7160 进行检测,但不影响 PathScan Total Akt1 Sandwich ELISA kit #7170检测 Akt1 总蛋白的水平。OD450 读数如顶部图所示,而使用 Phospho-Akt (Ser473) Antibody #9271 或 Akt Antibody #9272的相应蛋白质印迹如底部图所示。

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图 4:对照 NIH/3T3 细胞(虚线)或经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞(实线)裂解物蛋白浓度与试剂盒测定的光密度读数之间存在线性关系。

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图 3:对使用 Akt Antibody #9272 检测重组非磷酸-Akt1 蛋白时夹心 ELISA 与蛋白质印迹法之间的敏感度进行比较。顶部图表明,蛋白为 0-1,000 pg 时,非磷酸-Akt1 的浓度与使用 Sandwich ELISA kit 所获得的 OD450 读数呈线性比例关系。

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图 2:对使用 Akt Antibody #9272 检测重组磷酸-Akt1 蛋白时夹心 ELISA 与蛋白质印迹法之间的敏感度进行比较。顶部图表明,蛋白为 0-500 pg 时,磷酸-Akt1 的浓度与使用 Sandwich ELISA kit 获得的 OD450 读数呈线性比例关系。

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产品包括 体积 溶液颜色
Akt Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Akt1 Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 2 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Sealing Tape 2 ea
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

CST 的 PathScan® Total Akt1 Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能检测内源水平的 Akt1 总蛋白。Akt Antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 Akt 蛋白。充分洗涤后,加入 Akt1 Mouse Monoclonal Antibody 来检测捕获的 Akt1 总蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的光密度值与 Akt1 总蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

CST 的 PathScan® Total Akt1 Sandwich ELISA Kit 可检测内源水平的磷酸化和非磷酸化 Akt1。在 NIH/3T3 细胞中,使用 PathScan Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA kit #7160 可检测 LY294002 对 Akt 丝氨酸 473 磷酸化的抑制,而使用 ELISA kit #7170 检测的 Akt1 总蛋白的水平保持不变,如图 1 所示。在 Jurkat 细胞中也观察到类似的结果(未显示数据)。这种 ELISA kit 无法检测相关激酶,如 PKC 和 p70 S6 激酶。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

Akt也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14),并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16),参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是,Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)(在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子)(18,19)。

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  2. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.
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Entrez-Gene Id
207
Swiss-Prot Acc.
P31749
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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