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7179
PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit

PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit #7179

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像 1

图 1:HEK-293T 细胞用氨基酸和胰岛素处理会刺激4E-BP1 在Thr37/46位点的磷酸化,可使用 PathScan® Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) Sandwich ELISA Kit #7216 进行检测,但不影响 PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit #7179 检测的 4E-BP1 总蛋白的水平。HEK-293T 细胞(70-80% 融合度)饥饿过夜,并剥夺氨基酸 1 小时。补充氨基酸 1 小时。细胞未经处理或用 100 nM 胰岛素在 37ºC 下刺激 30 分钟。夹心 ELISA 和蛋白质印迹分析表明,对照的细胞裂解物用 λ 磷酸酶处理(4000 U/mL,60 分钟,在 37ºC 下)会减弱 4E-BP1 基础磷酸化。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 4E-BP1 Antibody #9452(左小图)或 Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) Antibody #9459(右小图)检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

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敏感图像 2

图 2:氨基酸 (AA)/未经处理的和已经 AA/胰岛素处理的 HEK-293T 细胞裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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特异性图像 3

图 3.对 ELISA 微孔捕获的蛋白进行蛋白质印迹分析证实了试剂盒的特异性。裂解物用 HEK-293T 细胞制备,并在 4E-BP1 捕获抗体包被的微孔中孵育。洗涤各孔,捕获的蛋白在 SDS 凝胶上样缓冲液中进行溶解。使用 4E-BP1 Antibody #9452 对 HEK-293T 细胞的初步裂解物(泳道 1 和 2)和捕获蛋白(泳道 3 和 4)进行蛋白质印迹分析。在捕获物质(泳道 3 和 4)中检测到的主要条带对应于 4E-BP1。

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产品包括 体积 溶液颜色
4E-BP1 Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
4E-BP-1 Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 2 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅部分 A,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅部分 A,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

CST 的 PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附剂测定 (ELISA) 试剂盒,可检测内源水平的 4E-BP1 。4E-BP1 Rabbit Antibody 被包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 4E-BP1(磷酸和非磷酸)。充分洗涤后,加入 4E-BP1 Mouse Detection Antibody 来检测捕获的 4E-BP1 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与 4E-BP1 总蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

CST 的 PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit #7179 可检测内源水平的 4E-BP1 。如图 1 所示,使用 CST 的 PathScan® Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) Sandwich ELISA Kit #7216时,补充氨基酸后在经胰岛素处理 30 分钟且经血清和氨基酸饥饿的 HEK-293T 细胞中检测到显著诱导的 4E-BP1 Thr37/46 磷酸化。蛋白质印迹分析表明,使用 PathScan® Total 4E-BP1 Sandwich ELISA Kit #7179 识别的总 4E-BP1(磷酸化和非磷酸形式)的水平保持不变。

经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

翻译抑制蛋白 4E-BP1(也称为 PHAS-1)可通过结合翻译起始因子 eIF4E 抑制帽子结构依赖性翻译。4E-BP1 的高度磷酸化会扰乱这种相互作用,进而导致帽子结构依赖性翻译被激活 (1)。PI3 激酶/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶均可调节 4E-BP1 活性 (2,3)。多个 4E-BP1 残基在体内被磷酸化 (4)。一般认为FRAP/mTOR 在 Thr37 和 Thr46 的磷酸化虽然不会阻碍 4E-BP1 与 eIF4E的结合,但会引导4E-BP1 后续在 Ser65 和 Thr70 的磷酸化 (5)。

  1. Pause, A. et al. (1994) Nature 371, 762-7.
  2. Brunn, G.J. et al. (1997) Science 277, 99-101.
  3. Gingras, A.C. et al. (1998) Genes Dev 12, 502-13.
  4. Fadden, P. et al. (1997) J Biol Chem 272, 10240-7.
  5. Gingras, A.C. et al. (1999) Genes Dev 13, 1422-37.
Entrez-Gene Id
1978
Swiss-Prot Acc.
Q13541
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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