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7182
PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit #7182

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图 1. OVCAR8 细胞用 TPA 处理会刺激 Bad Ser112 磷酸化, 并可被PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit #7182检测,但不影响 PathScan® Total Bad Sandwich ELISA Kit #7162 检测的 Bad 总蛋白的水平。夹心 ELISA 和蛋白质印迹分析表明,对照的细胞裂解物用 λ 磷酸酶处理(4000 U/mL,60 分钟,37ºC)会减弱 Bad 基础磷酸化。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 Phospho-Bad (Ser112) Antibody #9296(右小图)或 Bad Antibody #9254(左小图)检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

图 2. 未经处理和已经 TPA 处理的 OVCAR8 细胞的裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。细胞经血清饥饿过夜后在 37ºC 下用 200 nm TPA 处理 30 分钟。

购买 # 7182C
产品货号 规格 价格 库存
7182C
1 个试剂盒(96 次检测)

重要订购明细

客户订购明细: 订购 5 个或更多试剂盒时,请联系我们了解处理时间和定价,联系方式为 sales@cellsignal.com

支持数据

反应性 H M Mk

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
Bad Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Phospho-Bad (Ser112) Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

CST 的 PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,可检测内源水平的磷酸化-Bad (Ser112) 蛋白。Bad rabbit mAb 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 Bad 蛋白(磷酸和非磷酸形式)。充分洗涤后,加入 phospho-Bad (Ser112) mouse mAb 来检测捕获的磷酸化-Bad 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与磷酸-Bad (Ser112) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

实验步骤

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ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

实验步骤编号:204

特异性/敏感性

CST 的 PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit #7182 可检测内源水平的磷酸化-Bad (Ser112) 蛋白。使用 PathScan® Phospho-Bad (Ser112) Sandwich ELISA Kit #7182 在经 TPA 处理的 OVCAR8 细胞中可检测显著诱导的 Bad Ser112 磷酸化。但 PathScan® Total Bad Sandwich ELISA Kit #7162 检测的 Bad 总蛋白(磷酸和非磷酸化形式)水平不变(图 1)。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 猴

背景

Bad 是 Bcl-2 促凋亡家族的一员,它通过转移 Bax 与 Bcl-2 和 Bcl-xL 结合而促进细胞死亡 (1,2)。存活因子(如 IL-3)能够通过激活细胞内信号转导通路,导致 Bad 在 Ser112 和 Ser136 位点被磷酸化,进而抑制 Bad 的凋亡活性 (2)。在这些位点的磷酸化会促进 Bad 与 14-3-3 蛋白结合,从而阻止 Bad 与 Bcl-2 和 Bcl-xl 的结合 (2)。Akt 在 Ser136 位点磷酸化 Bad 可促进细胞存活 (3,4)。Bad 在体内体外都能够被 p90RSK (5,6) 和线粒体锚定 PKA 在 Ser112 位点磷酸化 (7)。PKA 对 BH3 结构域 Ser155 位点的磷酸化在阻止 Bad 和 Bcl-xL 的二聚化过程中发挥重要作用 (8-10)。

  1. Yang, E. et al. (1995) Cell 80, 285-91.
  2. Zha, J. et al. (1996) Cell 87, 619-28.
  3. Datta, S.R. et al. (1997) Cell 91, 231-41.
  4. del Peso, L. et al. (1997) Science 278, 687-9.
  5. Bonni, A. et al. (1999) Science 286, 1358-62.
  6. Tan, Y. et al. (1999) J Biol Chem 274, 34859-67.
  7. Harada, H. et al. (1999) Mol Cell 3, 413-22.
  8. Tan, Y. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 25865-25869.
  9. Lizcano, J. et al. (2000) Biochem. J. 349, 547-557.
  10. Datta, S. et al. (2000) Mol. Cell 6, 41-51.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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