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7955
PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Sandwich ELISA Antibody Pair
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Sandwich ELISA Antibody Pair #7955

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图 1. 未经处理和已经 H2O2 处理的 C2C12 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Sandwich ELISA Antibody Pair #7955 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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ELISA Antibody Pair

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 洗涤缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、(20X PBST #9809)。
  3. 封闭缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、1% BSA。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1X:该缓冲液现成可用。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。

    建议:使用前,立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

  5. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  6. TMB 底物:(#7004)。
  7. STOP 溶液:(#7002)

    注意:试剂应每天新鲜制备。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5- 1 ml 冰冷的 PathScan® 夹心式 ELISA 裂解缓冲液 (1X) #7018 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 2 分钟。
  4. 将细胞裂解物采集到一根干净的试管中。
  5. 在 4°C 下离心分离 10 分钟 (14,000 x g),并将上清液转移到新试管中。上清液按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 重悬细胞沉淀物,试管在冰上孵育 2 分钟。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 微孔板用 200 μl dH2O 漂洗,丢弃液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板,添加 100 µl 捕获抗体原液到 9.9 ml 1 X PBS 中。混匀并按 100 µl/孔添加。盖住平板并在 4°C 孵育过夜(17–20 小时)。
  3. 在过夜包被后,轻柔地揭开平板的盖子,并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次200 μl。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。按 150 µl 封闭缓冲液/孔添加,盖住平板并在 37°C 下孵育 2 小时。
  5. 在封闭后,洗涤平板(C 部分,步骤 3)。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物使用时不稀释或在封闭缓冲液中稀释。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板,添加100 µl 检测抗体原液到 9.9 ml 封闭缓冲液中。混匀并按 100 µl/孔添加。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  5. 将二抗,即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP,在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板,添加 10 µl 二抗原液到 9.99 ml 封闭缓冲液中。混匀并按 100 µl/孔添加。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  7. 每孔添加 100 µl TMB 底物。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 每孔添加 100 µl STOP 液。温和振摇数秒。
  9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。

发布​于 2008 年 1 月 

修订于 2016 年 1 月

产品包括 体积 盖颜色
AMPKα Rabbit Capture Rabbit mAb (100X) 400 µl 粉色
Phospho-AMPKα (Thr172) Detection Mouse mAb (100X) 400 µl 蓝色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (1000X) 40 µl 黄色

CST 的 PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Sandwich ELISA Antibody Pair 是一种经济合算的选择,可替代 PathScan® Phospho-AMPKα-(Thr172) Sandwich ELISA Kit #7959。捕获和检测抗体以及 Anti-Mouse IgG, HRP-linked Antibody 分别以100X 原液和 1000X 原液的形式提供。所提供的试剂足以进行 4 x 96 孔 ELISA。AMPKα Rabbit Capture Antibody 在 96 孔的微孔板中用 PBS 包被过夜。封闭后,依次加入细胞裂解物、Phospho-AMPKα (Thr172) Mouse Detection Antibody 和 Anti-Mouse IgG, HRP-linked Antibody。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与磷酸化-AMPKα (Thr172) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

存储:

捕获和检测抗体存储在4ºC。HRP 标记二抗保存在 -20°C 下。

如需了解抗体对的特异性和敏感度,请参阅相应的 PathScan® Sandwich ELISA Kit。注意:经内部测试确定,该抗体对可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物中都高度保守,且在调节能量平衡方面发挥关键作用 (1)。AMPK 蛋白以一种异三聚体复合体的形式存在,由一个 α-催化亚基、一个 β-调节亚基和一个 γ-调节亚基组成,每个亚基被两到三个不同基因编码 (α1、2;β1、2;γ1、2、3) (2)。该激酶会被因细胞和环境压力引起AMP/ ATP 比值升高而激活,如热休克,缺氧和缺血 (1)。抑癌基因 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 一同将位于活化环里 Thr172 位点的 AMPKα 磷酸化,该位点的磷酸化是 AMPK 激酶活性所必需的 (3-5)。AMPKα 在 Thr258 位点和 Ser485 位点(对于 α1;α2 是 Ser491 位点)也被磷酸化。上游激酶以及这些磷酸化事件的生物学意义尚未被阐明 (6)。β1 亚基是通过豆蔻酰化和多位点磷酸化翻译后修饰的,这些位点包括 Ser24/25 位点、Ser96 位点、Ser101 位点、Ser108 位点和 Ser182 位点 (6,7)。β1 亚基 Ser108 位点的磷酸化似乎对 AMPK 酶活性是必要的,而 Ser24/25 位点和 Ser182 位点的磷酸化会影响 AMPK 定位 (7)。已确定了一些 AMPKγ 亚基的突变,其中大部分位于假定的 AMP/ ATP 结合位点(CBS 或Bateman域)。这些位点的突变导致 AMPK 活性降低,引起心脏或骨骼肌糖原积累 (1,2)。越来越多证据表明,AMPK 不仅调节脂肪酸和糖原的代谢,也通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路调节蛋白质合成和细胞生长,另外还通过 eNOS / nNOS 调节血流量 (1)。

  1. Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 3329-35.
  6. Woods, A. et al. (2003) J Biol Chem 278, 28434-42.
  7. Warden, S.M. et al. (2001) Biochem J 354, 275-83.
Entrez-Gene Id
5562 , 5563
Swiss-Prot Acc.
Q13131P54646
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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