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7792
PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7792

Citations (0)

图 1:已经磷酸酶处理和已经 H2O2 处理的 C2C12 细胞的裂解物蛋白浓度与使用化学发光底物所产生的直接发光程度之间的关系如图所示。C2C12 细胞(80-90 融合度)用 H2O2 处理(10 mM,10 分钟,37ºC)。阴影区域对应的插入图表表明在低蛋白浓度范围内的高敏性和直线反应。

购买 # 7792C
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7792C
1 个试剂盒(96 次实验)

重要订购明细

客户订购明细: 订购 5 个或更多试剂盒时,请联系我们了解处理时间和定价,联系方式为 sales@cellsignal.com

支持数据

反应性 H M
产品包括 体积 溶液颜色
AMPKα Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Phospho-AMPKα (Thr172) (M160C2) Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 5.5 ml 绿色
HRP Diluent 5.5 ml 红色
Luminol/Enhancer Solution 3 ml
Stable Peroxide Buffer 3 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) 7018 30 ml

产品说明

PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能通过化学发光读取的方式检测内源水平的磷酸-AMPKα (Thr172) 蛋白。与传统显色法检测相比,化学发光 ELISA 通常有更宽泛的动态范围和更高的敏感度。以低容量微孔板提供的这种化学发光 ELISA 在使用较小样品时能增强信号和敏感度。AMPKα Rabbit mAb 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获 AMPKα(磷酸和非磷酸形式)。充分洗涤后,加入 Phospho-AMPKα (Thr172) Mouse Detection Antibody 来检测捕获的磷酸-AMPKα (Thr172) 蛋白。随后加入 HRP-linked, anti-mouse antibody 检测结合的检测抗体。添加化学发光试剂来增强信号。发光程度(按相对光单位 (RLU) 测量)与磷酸-AMPKα (Thr172) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

实验步骤

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ELISA 化学发光法(冻干)

注意:请参阅产品专用数据表,以了解测定的孵育温度。这种化学发光 ELISA 在小体积微量平板中提供。每个微孔仅需 50 µl 样品或试剂

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 0.5 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 0.5 ml 重新配制的检测抗体到 5.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 0.5 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 0.5 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 5.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 5.5 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 5.5 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. Luminol/Enhancer Solution 和 Stable Peroxide Buffer

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5- 1 ml 冰冷的 PathScan® 夹心式 ELISA 裂解缓冲液 (1X) #7018 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 2 分钟。
  4. 将细胞裂解物采集到一根干净的试管中。
  5. 在 4°C 下离心分离 10 分钟 (14,000 x g),并将上清液转移到新试管中。上清液按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心分离(约 1200 rpm)采集细胞,并用 5-10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 重悬细胞沉淀物,并在试管中孵育 2 分钟。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或已稀释的细胞裂解物中取出 50 μl 添加到相应孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。在室温下孵育平板 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 150 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 50 μl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅部分 A,步骤 2)。用胶带密封并将平板在室温孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 50 μl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅部分 A,步骤 3)。用胶带密封并将平板在室温孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution 和 Stable Peroxide 来制备检测试剂工作液。
  10. 向每个孔添加 50 µl 检测试剂工作液。
  11. 添加底物 1-10 分钟后,使用平板光度计测量在 425 nm 处的相对光单位 (RLU)。在 10 分钟内读数时,可实现最佳信号强度。

发布​于 2013 年 11 月 

修订于 2016 年 1 月

实验步骤编号:203

特异性/敏感性

PathScan® Phospho-AMPKα (Thr172) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit 可检测内源水平的磷酸-AMPKα (Thr172) ,如图 1 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

背景

AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物中都高度保守,且在调节能量平衡方面发挥关键作用 (1)。AMPK 蛋白以一种异三聚体复合体的形式存在,由一个 α-催化亚基、一个 β-调节亚基和一个 γ-调节亚基组成,每个亚基被两到三个不同基因编码 (α1、2;β1、2;γ1、2、3) (2)。该激酶会被因细胞和环境压力引起AMP/ ATP 比值升高而激活,如热休克,缺氧和缺血 (1)。抑癌基因 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 一同将位于活化环里 Thr172 位点的 AMPKα 磷酸化,该位点的磷酸化是 AMPK 激酶活性所必需的 (3-5)。AMPKα 在 Thr258 位点和 Ser485 位点(对于 α1;α2 是 Ser491 位点)也被磷酸化。上游激酶以及这些磷酸化事件的生物学意义尚未被阐明 (6)。β1 亚基是通过豆蔻酰化和多位点磷酸化翻译后修饰的,这些位点包括 Ser24/25 位点、Ser96 位点、Ser101 位点、Ser108 位点和 Ser182 位点 (6,7)。β1 亚基 Ser108 位点的磷酸化似乎对 AMPK 酶活性是必要的,而 Ser24/25 位点和 Ser182 位点的磷酸化会影响 AMPK 定位 (7)。已确定了一些 AMPKγ 亚基的突变,其中大部分位于假定的 AMP/ ATP 结合位点(CBS 或Bateman域)。这些位点的突变导致 AMPK 活性降低,引起心脏或骨骼肌糖原积累 (1,2)。越来越多证据表明,AMPK 不仅调节脂肪酸和糖原的代谢,也通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路调节蛋白质合成和细胞生长,另外还通过 eNOS / nNOS 调节血流量 (1)。

  1. Hardie, D.G. (2004) J. Cell Sci. 117, 5479-5487.
  2. Carling, D. (2004) Trends Biochem. Sci. 29, 18-24.
  3. Hawley, S.A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 27879-27887.
  4. Lizcano, J.M. et al. (2004) EMBO J 23, 833-43.
  5. Shaw, R.J. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 3329-3335.
  6. Woods, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 28434-28442.
  7. Warden, S.M. et al. (2001) Biochem J. 354, 275-283.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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