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7020
PathScan® Phospho-ALK (Tyr1604) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-ALK (Tyr1604) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7020

酶联免疫吸附测定法图像库导航1

在添加(磷酸)和不添加(非磷酸)磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中,裂解的 NCI-H2228 细胞裂解物与蛋白浓度之间的关系。阴影区域对应的插入图表表明在低蛋白浓度范围内的高敏性和直线反应。

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产品包括 体积 溶液颜色
Phospho-ALK (Tyr1604) Rabbit Antibody Coated Microwells 96 次测试
ALK Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 5.5 ml 绿色
HRP Diluent 5.5 ml 红色
Luminol/Enhancer Solution 3 ml
Stable Peroxide Buffer 3 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml 无色
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 化学发光法(冻干)

注意:请参阅产品专用数据表,以了解测定的孵育温度。这种化学发光 ELISA 在小体积微量平板中提供。每个微孔中仅需要 50 µl 样品或试剂。

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 0.5 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 0.5 ml 重新配制的检测抗体到 5.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 0.5 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 0.5 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 5.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 5.5 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 5.5 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. Luminol/Enhancer Solution 和 Stable Peroxide Buffer

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心分离(约 1200 rpm)采集细胞,并用 5-10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 50 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。在室温下孵育平板 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 150 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 50 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封并将平板在室温孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 50 µl 复溶的 HRP 标记二抗(红色)(参阅部分 A,步骤 3)。用胶带密封并将平板在室温孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution and Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
  10. 向每个孔添加 50 µl 工作液。
  11. 添加底物 1-10 分钟后,使用平板光度计测量在 425 nm 处的相对光单位 (RLU)。在 10 分钟内读数时,可实现最佳信号强度。

发布​于 2013 年 11 月 

PathScan® Phospho-ALK (Tyr1604) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能通过化学发光读取的方式检测内源水平的磷酸-ALK (Tyr1604)、磷酸-EML4-ALK 或磷酸-NPM-ALK 融合蛋白。与传统显色法检测相比,化学发光 ELISA 通常有更宽泛的动态范围和更高的敏感度。以低容量微孔板形式提供的该化学发光 ELISA ,即便使用较小样品量,依然能显示增加的信号和敏感度。phospho-ALK (Tyr1604) rabbit antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体仅可捕获磷酸化-ALK (Tyr1604) 和磷酸化-ALK 融合蛋白。充分洗涤后,加入 ALK mouse mAb 来检测捕获的磷酸-ALK (Tyr1604) 和磷酸-ALK 融合蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody 检测结合的检测抗体。添加化学发光试剂来增强信号。发光度值(按相对光单位 (RLU) 测量)与磷酸化-ALK (Tyr1604) 或磷酸化-ALK 融合蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

PathScan® Phospho-ALK (Tyr1604) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7020 可检测人细胞中内源水平的磷酸化-ALK (Tyr1604) 蛋白、磷酸化-EML4-ALK 和磷酸化-NPM-ALK 融合蛋白。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 是多效生长因子 (PTN) 的一种酪氨酸激酶受体,PTN 是与胚胎脑发育有关的生长因子 (1-3)。在表达 ALK 的细胞中,PTN 诱导 ALK 和下游效因子 IRS-1、Shc、PLCγ 和 PI3 激酶发生磷酸化 (1)。ALK 最初被发现是转位产生的一种核磷蛋白 (NPM)-ALK 融合蛋白 (4)。研究人员发现,NPM-ALK 融合蛋白是一种与间变性淋巴瘤相关的结构激活且会致癌的酪氨酸激酶 (4)。研究文献表明,NPM-ALK 激活 PLCγ 可能是有丝分裂活性的关键步骤,可能与间变性淋巴瘤的发病机理有关 (5)。

针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系的研究文献,描述了与 ALK 和棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4) 的不同的 ALK 致癌融合蛋白,并且在某些肺腺癌病例中存在相应融合转录蛋白。微管相关蛋白 EML4 的短氨基末端区域能融合到 ALK 的激酶结构域 (6-8)。

  1. Stoica, G.E. et al. (2001) J Biol Chem 276, 16772-9.
  2. Iwahara, T. et al. (1997) Oncogene 14, 439-49.
  3. Morris, S.W. et al. (1997) Oncogene 14, 2175-88.
  4. Morris, S.W. et al. (1994) Science 263, 1281-4.
  5. Bai, R.Y. et al. (1998) Mol Cell Biol 18, 6951-61.
  6. Rikova, K. et al. (2007) Cell 131, 1190-203.
  7. Takeuchi, K. et al. (2008) Clin Cancer Res 14, 6618-24.
  8. Soda, M. et al. (2007) Nature 448, 561-6.
Entrez-Gene Id
238
Swiss-Prot Acc.
Q9UM73
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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