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7144
PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Antibody Pair
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Antibody Pair #7144

夹心酶联免疫吸附测定法图像库导航1

未经处理和已经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Antibody Pair #7144 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。饥饿过夜后,NIH/3T3 细胞在 37ºC 下用 PDGF (50 ng/ml) 处理 10 分钟后再进行裂解。

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ELISA Antibody Pair

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 洗涤缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、(20X PBST #9809)。
  3. 封闭缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、1% BSA。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:10X 细胞裂解缓冲液 (#9803):要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液,则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH2O 中,混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。

    建议:使用前,立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

  5. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  6. TMB 底物:(#7004)。
  7. STOP 溶液:(#7002)

    注意:试剂应每天新鲜制备。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 用 200 µl dH2O 淋洗微量平板,弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板,添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜(17–20 小时)。
  3. 在过夜包被后,轻柔地揭开平板的盖子,并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次,每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔,盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  5. 在封闭后,洗涤平板(C 部分,步骤 3)。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板,添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  5. 将二抗,即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP,在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板,添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
  9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。

发布​于 2008 年 1 月 

修订于 2013 年 9 月

产品包括 体积 盖颜色
Akt Capture Rabbit mAb (100X) 400 µl 粉色
Phospho-Akt (Thr308) Detection Mouse mAb (100X) 400 µl 蓝色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (1000X) 40 µl 黄色

CST 的 PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Antibody Pair 是 PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Sandwich ELISA Kit #7252 的一种经济合算的替代物。捕获和检测抗体以及 HRP 标记二抗分别作为 100X 原液和 1000X 原液提供。提供的试剂足以进行 4 x 96 孔的 ELISA 测定。Akt Rabbit Capture Antibody 在 96 孔微孔板中 PBS 包被过夜。封闭后,加入细胞裂解物,随后加入 Phospho-Akt (Thr308) Mouse Detection Antibody 和 HRP-conjugated Anti-Mouse IgG。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与磷酸-Akt (Thr308) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

存储:

捕获和检测抗体存储在4ºC。HRP 标记二抗保存在 -20°C 下。

如需了解抗体对的特异性和敏感度,请参阅相应的 PathScan® Sandwich ELISA Kit。注意:经内部测试确定,该抗体对可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

Akt也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14),并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16),参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是,Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)(在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子)(18,19)。

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Entrez-Gene Id
207 , 208 , 10000
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P31751 , Q9Y243
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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