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7135
PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7135

酶联免疫吸附测定法图像库导航1

图 1:未经处理和已经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的裂解物蛋白浓度与使用化学发光底物产生的即时发光度之间的关系如图所示。细胞(80% 融合度)用 PDGF #9909 (50 ng/ml) 处理,并在 37ºC 下孵育 5 分钟后进行裂解。阴影区域对应的插入图表表明在低蛋白浓度范围内的高敏性和直线反应。

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产品包括 体积 溶液颜色
Akt Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Phospho-Akt (Thr308) Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 5.5 ml 绿色
HRP Diluent 5.5 ml 红色
Luminol/Enhancer Solution 3 ml
Stable Peroxide Buffer 3 ml
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Sealing Tape 2 ea
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

化学发光 ELISA

注意:请参阅产品专用数据表或产品网页,以了解测定的孵育温度。这种 /产品/productDetail.jsp?productId=luminescent ELISA 提供于小体积微量平板中。样品和试剂仅需要 50 µl/微孔。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 10X PBS 到 950 ml dH2O 中,混匀。
  2. 使用前,让全部微孔板条达到室温。
  3. 用 dH2O 中稀释 20 X 洗涤缓冲液(包含于每个 PathScan®夹心 ELISA 试剂盒中),制备 1 X 洗涤缓冲液。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1X:该缓冲液现成可用。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。

    建议:使用前,立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

  5. 20X LumiGLO® Reagent and 20X Peroxide:(#7003)。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收取的细胞可以用含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封放置在储存袋中,并立即贮存在 4 °C 的环境中。
  2. 细胞裂解物可以不稀释使用或用样品稀释液(在每个 PathScan® 夹心 ELISA 试剂盒中供应,蓝色)稀释使用。每个试剂盒的独立数据表或产品网页中都提供了有关裂解物适宜稀释倍数和试剂盒分析结果的信息。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 50 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。在室温下孵育平板 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 温和取下胶带并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1 X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每次每孔 150 µl。
    3. 每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔中添加 50 µl 检测抗体(绿色)。用胶带密封并将平板在室温孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔中添加 50 µl HRP-连接的二抗(红色)。用胶带密封并将平板在室温孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 通过混合等份 2 X LumiGLO® 试剂和 2 X 过氧化物,配制检测试剂工作液。
  10. 向每个孔中添加 50 µl 检测试剂工作液。
  11. 使用设定在 425 nm 的基于平板的光度计在添加底物后 1-10 分钟内测量相对发光单位 (RLU)。
    1. 在 10 分钟内读数时,可实现最佳信号强度。

发布​于 2009 年 11 月 

修订于 2013 年 9 月

PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能通过化学发光读取的方式检测内源水平的磷酸-Akt (Thr308) 蛋白。与传统显色法检测相比,化学发光 ELISA 通常有更宽泛的动态范围和更高的敏感度。以低容量微孔板提供的该化学发光 ELISA, 用较小样品量便可显示出增高的信号与敏感度。Akt rabbit antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获磷酸-和非磷酸-Akt 蛋白。充分洗涤后,加入 phospho-Akt (Thr308) mouse antibody 来检测捕获的磷酸-Akt 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody 检测结合的检测抗体。添加化学发光试剂来增强信号。发光度值(按相对光单位 (RLU) 测量)与磷酸化-Akt (Thr308) 蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

PathScan® Phospho-Akt (Thr308) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7135 可检测人和小鼠细胞中内源水平的磷酸化-Akt (Thr308)。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

Akt也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14),并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16),参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是,Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)(在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子)(18,19)。

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Entrez-Gene Id
207 , 208 , 10000
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P31751 , Q9Y243
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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