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7986
PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Sandwich ELISA Kit #7986

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像库导航 1

图 1. Hep G2 细胞用 H2O2 处理会刺激ACC 在Ser79位点的磷酸化,可使用 PathScan® Phospho-ACC (Ser79) Sandwich ELISA Kit #7986进行检测,但不影响 PathScan® Total ACC Sandwich ELISA Kit #7996 检测的ACC 总水平。Hep G2 细胞(80-90% 融合度)用 10 mM 过氧化氢处理 10 分钟,并用 #7018 进行裂解。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 Acetyl-CoA Carboxylase (C83B10) Rabbit mAb #3676(左小图)或 Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Antibody #3661(右小图)检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

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图 2. 未经处理和已经 H2O2 处理的 Hep G2 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Sandwich ELISA Kit 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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产品包括 体积 溶液颜色
Phospho-ACC (Ser79) Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Acetyl-CoA Carboxylase Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) 7018 30 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5- 1 ml 冰冷的 PathScan® 夹心式 ELISA 裂解缓冲液 (1X) #7018 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 2 分钟。
  4. 将细胞裂解物采集到一根干净的试管中。
  5. 在 4°C 下离心分离 10 分钟 (14,000 x g),并将上清液转移到新试管中。上清液按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 重悬细胞沉淀物,试管在冰上孵育 2 分钟。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或已稀释的细胞裂解物中取出 100 μl 添加到相应孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 μl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅部分 A,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 μl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅部分 A,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 μl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

修订于 2016 年 1 月

PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附剂测定 (ELISA) 试剂盒,能检测在 Ser79 位点被磷酸化的内源水平的乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC)。phospho-ACC (Ser79) rabbit antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获磷酸-ACC 蛋白。充分洗涤后,加入 ACC mouse detection mAb 来检测捕获的 ACC 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与在 Ser79 位点被磷酸化的 ACC 的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

当 ACC 蛋白在 Ser79 位点被磷酸化时,PathScan® Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Sandwich ELISA Kit 可检测内源水平的 ACC 蛋白,如图 1 所示。试剂盒的敏感度如图 2 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC) 可催化乙酰辅酶 A 羧化形成丙二酰辅酶 A (1)。它是脂肪酸生物合成和氧化过程中的一种关键酶 (1)。在啮齿动物中,265 kDa ACC1 (ACCα) 形式主要在脂肪生成组织中表达,而 280 kDa ACC2 (ACCβ) 则是氧化组织中的主要同工型 (1,2)。但在人类中,ACC2 是脂肪生成和氧化组织中的主要同工型 (1,2)。AMPK 在 Ser79 位点的磷酸化或 PKA 在 Ser1200 位点的磷酸化会抑制 ACC 的酶活性 (3)。ACC 是抗肥胖药物的潜在靶标 (4,5)。

  1. Castle, J.C. et al. (2009) PLoS One 4, e4369.
  2. Kreuz, S. et al. (2009) Diabetes Metab Res Rev 25, 577-86.
  3. Ha, J. et al. (1994) J Biol Chem 269, 22162-8.
  4. Abu-Elheiga, L. et al. (2001) Science 291, 2613-6.
  5. Levert, K.L. et al. (2002) J Biol Chem 277, 16347-50.
Entrez-Gene Id
31 , 32
Swiss-Prot Acc.
Q13085O00763
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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