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7123
PathScan® Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit #7123

ELISA - 蛋白质印迹相关性图像库导航 1

图 1. COS 细胞用曲古抑菌素 A (TSA) 处理会增强组蛋白 H3 在 Lys4 位点的单甲基化,使用 PathScan® Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit #7123 可进行检测。TSA 处理不会影响蛋白质印迹分析检测的组蛋白 H3 的水平。COS 细胞(70-80% 融合度)在 37ºC 下用 0.4 μM TSA 处理 16­18 小时。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 Histone H3 Antibody #9715(左小图)或 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Antibody #9723(右小图)检测到的相应蛋白质印迹如底部图所示。

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图 2. 未经处理和已经 TSA 处理的 COS 细胞的裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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产品包括 体积 溶液颜色
Histone H3 RmAb Coated Microwells 96 次测试
Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Rabbit Detection mAb (Biotinylated) 1 个 绿色(冻干)
HRP-Linked Streptavidin (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液和试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2013 年 11 月 

PathScan® Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,可检测在 Lys4 位点被单甲基化的内源水平的组蛋白 H3。Total Histone H3 Rabbit mAb 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获总组蛋白 H3。充分洗涤后,加入生物素化 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Rabbit Antibody 来识别单甲基化组蛋白 H3 (Lys4)。随后使用 HRP-linked streptavidin 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与在 Lys4 位点被单甲基化的组蛋白 H3 的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

CST 的 PathScan® Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit #7123 可检测在 Lys4 位点被单甲基化的内源水平的组蛋白 H3。如图 1 所示,使用 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) Sandwich ELISA Kit #7123 在经 TSA 处理的 COS 细胞中可检测到组蛋白 H3 在 Lys4 位点的高水平单甲基化。蛋白质印迹分析表明,总组蛋白 H3(修饰和未修饰)的水平不变(图 1)。NIH/3T3 和 Jurkat 细胞用 TSA 处理时会获得类似结果(未显示数据)。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

染色质结构调节在真核生物的转录调控中扮演着重要角色。核小体是染色质的基本结构单位,由 DNA 缠绕八个核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4 各 2 个)组成 (1)。核心组蛋白的氨基端尾部常发生多种翻译后修饰,包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化 (2-5)。这些修饰都是针对不同刺激而产生的反应,且会直接影响染色质对转录因子的可接近性,进而影响基因表达 (6)。在多数物种中,组蛋白 H2B 乙酰化主要发生在 Lys5、12、15和 20 位点上 (4,7)。而组蛋白 H3 的乙酰化则主要发生在 Lys9、14、18、23、27 和 56 位点上。在一些生物体内,在 Lys9 位点 H3 的乙酰化修饰似乎对组蛋白沉积和染色质组装有决定性的作用 (2,3)。组蛋白 H3 在 Ser10、Ser28 和 Thr11 位点上的磷酸化与有丝分裂和减数分裂期间的染色体浓缩紧密相关 (8-10)。组蛋白 H3 在 Thr3 位点上的磷酸化在许多物种中是高度保守的,并由激酶 haspin 催化完成。在哺乳动物细胞内用磷酸化特异性抗体进行免疫染色,发现有丝分裂中 H3 在 Thr3 位点的磷酸化发生在前期,而去磷酸化则发生在后期 (11)。

  1. Workman, J.L. and Kingston, R.E. (1998) Annu Rev Biochem 67, 545-79.
  2. Hansen, J.C. et al. (1998) Biochemistry 37, 17637-41.
  3. Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000) Nature 403, 41-5.
  4. Cheung, P. et al. (2000) Cell 103, 263-71.
  5. Bernstein, B.E. and Schreiber, S.L. (2002) Chem Biol 9, 1167-73.
  6. Jaskelioff, M. and Peterson, C.L. (2003) Nat Cell Biol 5, 395-9.
  7. Thorne, A.W. et al. (1990) Eur J Biochem 193, 701-13.
  8. Hendzel, M.J. et al. (1997) Chromosoma 106, 348-60.
  9. Goto, H. et al. (1999) J Biol Chem 274, 25543-9.
  10. Preuss, U. et al. (2003) Nucleic Acids Res 31, 878-85.
  11. Dai, J. et al. (2005) Genes Dev 19, 472-88.
Entrez-Gene Id
8350
Swiss-Prot Acc.
P68431
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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