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32614
FastScan™ Phospho-c-Jun (Ser63) ELISA Kit
ELISA 试剂盒

FastScan™ Phospho-c-Jun (Ser63) ELISA Kit #32614

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图 1. 3T3 细胞用紫外线辐射处理会刺激 c-Jun Ser63 磷酸化,但不影响总 c-Jun 的水平。未经和已经紫外线处理的 3T3 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 FastScan™ Phospho-c-Jun (Ser63) ELISA Kit #32614 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如上部结果图所示。使用 phospho-c-Jun (Ser63) 抗体(左小图)和 c-Jun 抗体(右小图)检测到的相应蛋白印迹如下部结果图所示。3T3 细胞用紫外线处理(50 mJ/cm2,在 37°C 下恢复 60 分钟)后进行裂解。

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产品包括 容量(计数) 溶液颜色
FastScan™ ELISA Microwell Strip Plate, 96 Well 53257 1 x 96 次检测
Phospho-c-Jun (Ser63) Rabbit Capture mAb 1 x 1 次 绿色(冻干)
c-Jun Mouse HRP-linked mAb 1 x 1 次 红色(冻干)
FastScan™ ELISA Capture Antibody Diluent 1 x 3 ml 绿色
FastScan™ ELISA HRP Antibody Diluent 1 x 3 ml
TMB Substrate 7004 1 x 11 ml
STOP Solution 7002 1 x 11 ml
Sealing Tape 1 x 1 次
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 1 x 25 ml
FastScan™ ELISA Cell Extraction Buffer (5X) 69905 1 x 10 ml
FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) 25243 1 x 1 ml
FastScan™ ELISA Kit #32614 Positive Control 2 x 1 ea

FastScan™ ELISA 实验步骤

A. 溶液和试剂

注意:用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。
仅制备实验当天所需的足够试剂。

  1. FastScan™ ELISA 微孔板条板,96 孔 (#53257):开封/使用前请将所有微孔板条恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
  2. 1X ELISA 洗涤缓冲液:通过使用去离子水稀释 ELISA 洗涤缓冲液 (20X)(每个试剂盒中均有提供)至 1X 来制备。
  3. 1X 细胞提取缓冲液:通过使用去离子水稀释 FastScan™ ELISA 细胞提取缓冲液 (5X) #69905 和 FastScan™ ELISA Cell 细胞提取增强剂溶液 (50X) #25243* 至 1X 来制备。这种缓冲液可保存在 4°C 下以供短期使用(1 - 2 周)。要制备 10 mL 1X 细胞提取缓冲液,则混合 7.8 mL 去离子水、2 mL FastScan™ ELISA 细胞提取缓冲液 (5X) 和 200 μL FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X)。或者,可以在提取细胞或组织后将增强剂溶液添加到细胞提取缓冲液中。当使用 1X 细胞提取缓冲液作为用于检测的样品稀释剂时,建议在使用前将其平衡至室温。

*重要提示:提供的 FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X) 保存在 4°C 下时可能会产生沉淀。要溶解,则在 37°C 下短暂加热并轻轻混合。FastScan™ ELISA 细胞提取增强剂溶液 (50X) 可保存在室温下,以避免沉淀。

:1X 细胞提取缓冲液含有磷酸酶抑制剂。应在裂解细胞之前立即将蛋白酶抑制剂加入 1X 细胞提取缓冲液中。还可添加其他磷酸酶抑制剂(例如蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 (100X) #5872,未提供)。

  1. FastScan™ ELISA Capture 抗体稀释剂:绿色稀释剂,用于重新配制 Capture 抗体。
  2. FastScan™ ELISA HRP 抗体稀释剂:用于重新配制 HRP-偶联抗体 的稀释剂(琥珀色瓶)。避光保存。
  3. 4X Capture 抗体:用 3 mL FastScan™ ELISA Capture 抗体稀释剂(绿色稀释剂)重新配制冻干 Capture 抗体(绿色块状物)。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。为获得最佳结果,请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的 4X Capture 抗体 可在 4°C 下保存长达 4 周,尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
  4. 4X HRP-偶联抗体:用 3 mL FastScan™ ELISA HRP 抗体稀释剂重新配制冻干 HRP-偶联抗体(红色块状物)。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。为获得最佳结果,请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的 4X HRP-偶联抗体 可在 4°C 下避光保存长达 4 周,尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
  5. 抗体混合物:在检测前立即混合等体积经重新配制的 4X Capture 和 4X HRP-偶联抗体并混匀。要制备 6 mL 抗体混合物(足以用于 1 块 96 孔板),则混合 3 mL 4X Capture 抗体 与 3 mL 4X HRP-偶联抗体。
  6. 阳性对照:加入 250 μL 去离子水以重新配制 1 瓶冻干阳性对照。轻轻地充分混合,在室温下保持 1 分钟,随后按照以下“检测程序”部分中列出的步骤进行操作。建议在去离子水中进行重新配制后立即使用阳性对照,但是剩余物质可保存在 -80°C 下(在冷冻/解冻的情况下可能会存在一些阳性对照信号丢失)。阳性对照作为一种对照试剂提供,而不是作为一种绝对定量方法。
  7. TMB 底物 (#7004):使用前请恢复至室温。
  8. STOP 溶液 (#7002):使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80-90% 融合度时,吸出培养基。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS 并向每块板(直径为 10 cm)添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞提取缓冲液(建议按需补充蛋白酶抑制剂和其他磷酸酶抑制剂),并在冰上孵育板 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 5 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5-1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)去除培养基。
  2. 用冰冷的 1X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞提取缓冲液(建议按需补充蛋白酶抑制剂和其他磷酸酶抑制剂)中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 5 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

:在运行检测之前,请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

  1. 如上(第 A 部分)所述制备所有试剂。
  2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞提取缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度,以便在添加抗体混合物后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
  3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品或阳性对照。
  4. 向每孔添加 50μL 抗体混合物。
  5. 用提供的密封胶带对板进行密封,并在室温下于设定为 400 rpm(中度振荡)的平板摇床上孵育 1 小时。
  6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X ELISA 洗涤缓冲液洗涤 3 次*,每孔每次 200 μL。每次洗涤后,将孔吸干或倒空。倒转平板并用干净的纸巾将其吸干,以便除去每个孔中的残留溶液,但无论何时都不得让孔完全干燥。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。

*注:某些 FastScan™ ELISA Kit 可能需要在这个步骤额外洗涤。任何额外洗涤的要求都将在试剂盒数据表的产品“说明”中特别注明。

  1. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床(400 rpm,中度振荡)上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟,或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
  2. 向每个孔添加 100 μL STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果:
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​于 2018 年 5 月 

修订于 2018 年 11 月

FastScan™ Phospho-c-Jun (Ser63) ELISA Kit 是一种夹心酶联免疫吸附剂检测 (ELISA) 试剂盒,能检测在 Ser63 位点被磷酸化的 c-Jun 的内源水平。要进行这种检测,样品用一种偶联专有标签的捕获抗体以及一种偶联 HRP 的检测二抗孵育,从而在溶液中与磷酸化 c-Jun (Ser63) 形成一个夹心结构。这整个复合体用一种抗标签抗体固定在平板上。随后洗涤各孔以清除未结合的物质。然后添加 TMB。观察到的信号振幅与磷酸化 c-Jun (Ser63) 的数量成比例。该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

FastScan™ Phospho-c-Jun (Ser63) ELISA Kit 可检测在 Ser63 位点被磷酸化的 c-Jun 的内源水平,如结果图 1 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

c-Jun 蛋白是 Jun 家族成员,该家族还包括 c-Jun、JunB 和 JunD,并且c-Jun 蛋白也是转录激活因子蛋白 1(AP -1)的组成部分。AP-1 包括 Fos 和 Jun 以及 ATF 家族成员的二聚体,能够结合并激活 TRE/AP-1-分子的转录(在 1 中论述)。包括生长因子、趋化因子和压力在内的胞外信号可激活 AP-1 依赖性转录过程。C-Jun 的转录活性可通过 SAPK/JNK 对 Ser63 和 Ser73 的磷酸化进行调控(在 2​中论述)。小鼠基因敲除实验表明 c-Jun 对于胚胎形成至关重要 (3),并且后续研究证明 c-Jun 在各种组织和发育过程中发挥作用,包括轴突再生 (4)、肝脏再生 (5) 和 T 细胞发育 (6)。AP-1 蛋白根据细胞类型和环境的不同,调节基因发挥各种生理功能包括细胞增殖、分化和凋亡,以及转化、侵袭和转移 (7-9)。其他靶基因能调节生存以及缺氧、血管生成 (8,10)。研究表明 c-Jun 可以作为癌症、血管重构、急性炎症反应和类风湿关节炎的重要治疗靶点 (11,12)。

  1. Jochum, W. et al. (2001) Oncogene 20, 2401-12.
  2. Davis, R.J. (2000) Cell 103, 239-52.
  3. Hilberg, F. et al. (1993) Nature 365, 179-81.
  4. Raivich, G. et al. (2004) Neuron 43, 57-67.
  5. Behrens, A. et al. (2002) EMBO J 21, 1782-90.
  6. Riera-Sans, L. and Behrens, A. (2007) J Immunol 178, 5690-700.
  7. Leppä, S. and Bohmann, D. (1999) Oncogene 18, 6158-62.
  8. Shaulian, E. and Karin, M. (2002) Nat. Cell Biol. 4, E131-E136.
  9. Weiss, C. and Bohmann, D. (2004) Cell Cycle 3, 111-3.
  10. Karamouzis, M.V. et al. (2007) Mol Cancer Res 5, 109-20.
  11. Kim, S. and Iwao, H. (2003) J Pharmacol Sci 91, 177-81.
  12. Dass, C.R. and Choong, P.F. (2008) Pharmazie 63, 411-4.
Entrez-Gene Id
3725
Swiss-Prot Acc.
P05412
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
FastScan™ ELISA 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。
第 9,086,407、9,261,500 和 9,476,874 号美国专利、外国对应专利以及由此衍生的子专利。

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