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7239
PathScan® Cell Growth Multi-Target Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒

PathScan® Cell Growth Multi-Target Sandwich ELISA Kit #7239

夹心酶联免疫吸附测定法图像库导航1

图 1. NIH/3T3 细胞用 PDGF 处理会诱导 Akt1 在 Thr308 和 Ser473 位点、S6 核糖体蛋白在 Ser235/236 位点以及 p44/42 MAPK 在 Thr202/Tyr204 位点的磷酸化,可使用 PathScan® Cell Growth Multi-Target Sandwich ELISA Kit #7239 进行检测 。在整个时间过程中可观察到动态磷酸化,而夹心 ELISA 和蛋白质印迹分析表明,总 p44/42 MAPK、Akt1 和 S6 核糖体蛋白的水平不变。NIH/3T3 细胞(80-90% 融合度)饥饿过夜,并在 37ºC 下用 PDGF (100 ng/mL) 刺激 5、10、20、40 和 80 分钟。裂解物蛋白浓度检测为 0.45 mg/mL。在 450 nm 处的吸光度读数如左图中的三维图所示,相应蛋白质印迹如右图所示。用于蛋白质印迹分析的抗体包括 S6 Ribosomal Protein Rabbit mAb #2217、Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Antibody #2211、Akt Antibody #9272、Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAb #4058、Phospho-Akt (Thr308) Antibody #9275、Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) (E10) Mouse mAb #9106、p44/42 MAP Kinase Antibody #9102。

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图 2. 描绘用于检测内源水平的 Akt1(红色;1 和 2)、磷酸-Akt1 (Ser473)(棕黄色;3 和 4)、磷酸-Akt1 (Thr308)(蓝色;5 和 6)、磷酸-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)(淡粉色;7 和 8)、S6 核糖体蛋白(紫色;9 和 10)以及磷酸-S6 核糖体蛋白 (Ser235/236)(绿色;11 和 12)试剂的颜色代码的 96 孔板示意图。

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产品包括 体积 溶液颜色
Cell Growth Multi-Target 96 次测试
Akt Rabbit mAb Coated Microwells 16 次测试
Akt1 Mouse Detection mAb 1.8 ml 绿色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit mAb Coated Microwells 16 次测试
Akt1 Mouse Detection Antibody 1.8 ml 绿色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
Akt Rabbit mAb Coated Microwells 16 次测试
Phospho-Akt (Thr308) Mouse Detection mAb 1.8 ml 绿色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
Phospho-p44/42 MAPK (T202/Y204) Rabbit mAb Coated Microwells 16 次测试
p44/42 MAPK Mouse Detection mAb 1.8 ml 绿色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
S6 Ribosomal Protein Mouse mAb Coated Microwells 16 次测试
S6 Ribosomal Protein Rabbit Detection mAb 1.8 ml 绿色
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Rabbit mAb Coated Microwells 16 次测试
S6 Ribosomal Protein Mouse Detection mAb 1.8 ml 绿色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 1.8 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml 无色
STOP Solution 7002 11 ml 无色
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml 无色
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml 淡黄色

ELISA 比色

注意:请参阅产品专用数据表或产品网页,以了解检测的孵育温度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L PBS:添加 50 ml 10X PBS 到 950 ml dH2O 中,混匀。
  2. 使用前,让全部微孔板条达到室温。
  3. 用 dH2O 稀释 20X Wash Buffer(每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中均包括)来配制 1X Wash Buffer。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:10X 细胞裂解缓冲液 (#9803):要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液,则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH2O 中,混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。

    建议:使用前,立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

    注意:请参阅产品专用数据表或网页,以了解裂解缓冲液建议。

  5. TMB 底物:(#7004)。
  6. STOP Solution:(#7002)。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封放置在储存袋中,并立即贮存在 4 °C 的环境中。
  2. 细胞裂解物不稀释或用样品稀释剂(每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中均提供,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表或产品网页中都提供了有关裂解物适宜稀释倍数和试剂盒分析结果的信息。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 温和取下胶带并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1 X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔中添加 100 µl 检测抗体(绿色)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔中添加 100 µl HRP-连接的二抗(红色)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 每孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 每孔添加 100 µl STOP 液。温和振摇数秒。

    注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 液,就变为黄色。

  11. 读取结果
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

CST 的 PathScan® Cell Growth Multi-Target Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,它由用于测试内源水平的 S6 核糖体蛋白、磷酸化-S6 核糖体蛋白 (Ser235/236)、Akt1、磷酸化-Akt (Ser473)、磷酸化-Akt (Thr308) 和磷酸化-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) 所必须的试剂而组成。这些分子是生长和分化调控通路中的关键信号转导蛋白。每种靶蛋白可以进行十六次检测。指定靶蛋白的特异性检测剂型可在与单独夹心 ELISA 试剂盒*相关的数据表中找到。简单地说,捕获抗体**包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获靶蛋白。充分洗涤后,加入检测抗体**来检测捕获的靶蛋白。随后使用 HRP 标记二抗检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与结合的靶蛋白的数量成比例。*见配套产品。试剂盒中的**抗体为针对该试剂盒的定制制剂。

CST 的 PathScan® Cell Growth Multi-Target Sandwich ELISA Kit #7239 可检测六种内源水平的蛋白:S6 核糖体蛋白、磷酸-S6 核糖体蛋白 (Ser235/236)、Akt1、磷酸-Akt (Ser473)、磷酸-Akt (Thr308) 和磷酸-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)。在 PDGF 的刺激下,随着时间的推移会观察到这些蛋白被激活。如图 1 所示,血清饥饿的 NIH/3T3 细胞用 PDGF 刺激会促进 Akt1 在 Thr308 和 Ser473 位点、S6 核糖体蛋白在 Ser235/236 位点以及 p44/42 MAPK 在 Thr202/Tyr204 位点的磷酸化。蛋白质印迹分析表明,在整个 80 分钟的过程中,每种靶蛋白(磷酸和非磷酸形式)的水平不变。

裂解物的蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系可在与单独 PathScan® Sandwich ELISA Kits* 有关的数据表中找到。*见配套产品。

经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

Akt 是一种原癌蛋白,在细胞生长、存活以及细胞周期等不同细胞进程中起到关键调控作用。Akt 还是胰岛素信号转导和葡萄糖代谢的一种主要调节分子 (1-4)。PI3 激酶信号转导、PDK1 磷酸化 Thr308 位点活化环以及 mTOR-rictor 复合体 (TORC1) 磷酸化 Ser473 位点羧基末端均会激活 Akt (5-7)。

p44 和 p42 MAP 激酶(Erk1 和 Erk2)在蛋白激酶级联中发挥作用,该级联又在调控细胞生长和分化中发挥关键作用 (8-13)。许多细胞外信号分子都能激活 MAP 激酶 ,其中包括生长、神经营养因子、cytokines、荷尔蒙和神经递质。单个上游 MAP 激酶 (MEK) 磷酸化序列 T*EY* 的苏氨酸和酪氨酸(人 MAP 激酶的 202 和 204;或大鼠 MAP 激酶的 183 或 185)会激活 MAP 激酶 (14,15)。

为有效且可持续地促进细胞生长和分裂,生长因子和有丝分裂原必须上调翻译 (16,17)。生长因子和分裂素诱导 p70 S6 激酶的激活,该激酶又能磷酸化 S6 核糖体蛋白。S6 核糖体蛋白的磷酸化与翻译增加有关,尤其是 5' 非翻译区域内含寡嘧啶链的 mRNA (17)。这组 mRNAs (5'TOP) 编码蛋白参与了细胞周期进程以及作为翻译机制部分的蛋白,如核糖体蛋白和延伸因子 (17,18)。主要的体内 S6 核糖体蛋白磷酸化位点(包括 Ser235、Ser236、Ser240 和 Ser244)位于 S6 羧基末端的小 19 氨基酸区域内 (19,20)。

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Entrez-Gene Id
207 , 5595 , 5594 , 6194
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P27361 , P28482 , P62753
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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