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29580
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers)
ChIP 试剂盒与试剂

SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580

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29580S
1 个试剂盒(24 次实验)

产品包括 容量(计数) 保存温度
Adaptor for Illumina® 1 x 240 µl -20°C
USER® Enzyme 1 x 72 µl -20°C
Universal PCR Primer for Illumina® 1 x 120 µl -20°C
Index 1 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 2 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 3 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 4 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 5 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 6 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 7 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 8 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 9 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 10 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 11 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C
Index 12 Primer for Illumina® 1 x 10 µl -20°C

存储:

所有组分都保存在 -20ºC 下。如果正确保存,本产品可保持稳定 12 个月。

实验步骤

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SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种高通量方法,可在染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测的下游用来检测和定量全基因组中的靶标 DNA 富集度。SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) 含有的接头蛋白和引物非常适合用于制备复用样本,以在 Illumina® 平台 (Illumina, Inc.) 上进行 NG-seq。这种试剂盒可用于生成多达 12 个不同且带条形码的 ChIP-seq DNA 库,DNA 库可合并到单个测序反应中。

每一个试剂盒组分都必须通过严格的质控标准,并且对于每一个新批次,都在 Illumina® 测序平台上通过构建和测序有索引的库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品含有的试剂足以制备多达 24 个 DNA 测序库,并且必须与 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 结合使用。

适合的 SimpleChIP® 试剂盒:

SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003、
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383、
SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795

不适合的 SimpleChIP® 试剂盒:

SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 、
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004。
注:琼脂糖微珠会封阻经声处理的鲑鱼精 DNA,这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需试剂
试剂包括:

  1. (红色)Adaptor for Illumina® #42436
  2. (红色)USER® Enzyme #59713
  3. (蓝色)Universal PCR Primer for Illumina® #12078
  4. (蓝色)Index 1 Primer for Illumina® #28248
  5. (蓝色)Index 2 Primer for Illumina® #41836
  6. (蓝色)Index 3 Primer for Illumina® #64036
  7. (蓝色)Index 4 Primer for Illumina® #83765
  8. (蓝色)Index 5 Primer for Illumina® #18392
  9. (蓝色)Index 6 Primer for Illumina® #27180
  10. (蓝色)Index 7 Primer for Illumina® #43985
  11. (蓝色)Index 8 Primer for Illumina® #68962
  12. (蓝色)Index 9 Primer for Illumina® #83219
  13. (蓝色)Index 10 Primer for Illumina® #90275
  14. (蓝色)Index 11 Primer for Illumina® #28019
  15. (蓝色)Index 12 Primer for Illumina® #39090

未包括的试剂:

  1. 适合用于制备 ChIP Illumina® NG-seq 库的酶和缓冲液:包含在 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 中
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect® Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 新鲜制备的 80% 乙醇
  5. 1X TE(10 mM Tris-HCl,pH 为 8.0,1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5)
  7. Magnetic Separation Rack #7017/#14654
  8. Bioanalyzer® 和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR

一. 简单的合并指南:

Illumina® NG-seq 平台使用红色激光/LED 给 A/C 测序,并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。对于每个周期,需要读取红色和绿色通道,以确保获得正确的图像配准(即 A 或 C 必须存在于每个周期中,且 G 或 T 也必须存在于每个周期中)。如果未保持色彩平衡,则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列,以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例:

索引表

以下表格列出了一些(但不是全部)可一起进行测序的有效索引组合:

可一起测序的有效索引组合

如果每个索引引物仅与 Universal PCR Primer for Illumina® 使用一次,则 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) 可生成 12 份不同的有条形码的样品。每个索引引物的量足以用于生成两个库,但这两个库无法合并到一个测序泳道中。

对于 1-plex(无混池),任意建立索引的引物均可与通用 PCR 引物共同使用。


II. Index 1-12 Primers for Illumina®

每份 Index Primer for Illumina® 的体积为 10 µl。

其中 -s- 表示硫代磷酸键。


三、设置 PCR 反应

  1. 确保是否使用了有效的索引引物组合。请参见第一和第二部分,验证是否选择了正确的引物组合。
  2. 每根 PCR 试管仅添加一份索引引物 () (5 µl) 和 5 µl 通用 PCR 引物 ()。更换试管之间的末端,以免发生交叉污染,这点非常关键。
  3. 记录添加到每根 PCR 试管的索引引物。
  4. 向含有引物的每根试管添加 25 µl Q5® PCR Master Mix ()。
  5. 往相应试管添加 15 µl 接头蛋白连接的 ChIP DNA,直至最终容量为 50 µl。轻轻上下摇晃 5–10 次以混匀。更换样品之间的末端,以免发生交叉污染,这点非常关键。
  6. 记录添加到每根 PCR 试管的接头蛋白连接的 DNA 样品。
  7. 根据建议的循环条件快速离心分离并进行 PCR(请参阅 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 实验步骤)。

附录:试剂盒组分的质量控制

SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 中的组分在下文所列的功能检测中进行了单独验证,且必须通过严格的质量控制标准。此外,每组组分都通过在 Illumina® 测序平台上构建和测序有索引的库来进行功能性验证。

一. Adaptor for Illumina® (15 μM) ()

5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入这种接头蛋白和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 这种接头蛋白和 1 μg φX174 RF I DNA,并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入至少 10 μl 这种接头蛋白,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。
  4. 核糖核酸酶活性:将这种接头蛋白和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时,经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。

II. USER® Enyzme ()

保存在 50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 μg/ml BSA 和 50% 甘油中

质量控制检测

  1. 非特异性脱氧核糖核酸酶活性(16 小时):在 50 μl 反应体积中加入 1 μg λ DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶,并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ HindIII DNA 和至少 25 个单位的 Endonuclease VIII,并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性(放射活性释放):在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶,并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 4 小时,最终释放的放射活性小于 0.1% 的总放射活性。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 10 个单位的 Endonuclease VIII,并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 4 小时,最终放射活性小于 0.5% 的总放射活性。
  3. 核酸内切酶活性(带切口):在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 超螺旋 φX174 DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶,并在 37°C 下用 UDG Reaction Buffer 孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳测定带切口形式的转化率低于 10%。
  4. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入至少 10 μl 1X USER Enzyme,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

三、Universal PCR Primer for Illumina® (10 μM) ()

5´-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC*T-3´

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 1 μl 这种引物和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μl 引物 和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也无可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 引物和 1 μg φX174 RF I DNA,并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性:将 1 μl 引物和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时,经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入至少 10 μl 这种引物,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

四、Index 1-12 Primers for Illumina® (10 μM) ()

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 1 µl Index [X] Primer for Illumina® 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 Index [X] Primer for Illumina® 和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入 1 µl Index [X] Primer for Illumina® 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋 DNA,并在 37°C 下孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II(带切口的分子)的转化率低于 10%。
  3. 核酸酶活性:在 10 μl 反应体积中加入 1 μl Index [X] Primer for Illumina® 和 40 ng 转录物,并在 37°C 下孵育 16 小时,经凝胶电泳确定没有可检测的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入 Index [X] Primer for Illumina®,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

发布​于 2017 年 11 月 

实验步骤编号:1626

实验步骤编号:1626

产品说明

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种高通量方法,可在染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测的下游用来检测和定量全基因组中的靶标 DNA 富集度。SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) 含有的接头蛋白和引物非常适合用于制备复用样本,以在 Illumina® 平台上进行 NG-seq。这种试剂盒可用于生成多达 12 个不同且带条形码的 ChIP-seq DNA 库,DNA 库可合并到单个测序反应中。

本产品含有的试剂足以制备多达 24 个 DNA 测序库,并且必须与 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 结合使用。

本产品适合 SimpleChIP® Enzymatic ChIP Kit (Magnetic Beads) #9003、SimpleChIP® Plus Enzymatic ChIP Kit (Magnetic Beads) #9005 和 SimpleChIP® Plus Sonication ChIP kit #56383。该产品不适合 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004,因为琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA,这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

特异性/敏感性

该试剂盒经验证可与 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 结合使用,以将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng ChIP DNA 用作起始物质来产生合格的 DNA 库。使用不同起始量的 ChIP DNA 制备的库显示,Bioanalyzer® 特征、基因组比对率、发现的结合波峰数量以及全基因组信噪比均相似。

物种反应性:

预期的所有物种

背景

染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法是一种用于在细胞天然染色质背景下探测蛋白质-DNA 相互作用的强大的通用技术 (1,2)。这种测定法用于检测与基因组某个特定区域有关的多种蛋白,或相反,用于检测某种特殊蛋白结合的基因组的多个区域 (3-6)。它可用于确定各种蛋白被募集到某个基因启动子上的特定顺序,或用于“测定”整个基因位点上某种特定组蛋白修饰的相对数量 (3,4)。除了组蛋白外,ChIP 测定法还可用于分析转录因子与辅助因子、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合。进行 ChIP 检测时,细胞或组织首先用甲醛固定,甲醛是一种可逆的蛋白-DNA 交联剂,可“维持”细胞中发生的蛋白-DNA 相互作用 (1,2)。细胞进行裂解,染色质采集后使用超声处理或酶消化法进行碎裂。染色质随后使用对某种特殊蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体进行免疫沉淀。任何与目标蛋白或组蛋白修饰有关的 DNA 序列都会作为交联染色质复合体的一部分进行共沉淀,并且该 DNA 序列的相对数量会在免疫选择过程中达到富集。免疫沉淀后,蛋白质-DNA 交联被逆转,DNA 得以纯化。标准 PCR 或定量实时 PCR 用于测量通过蛋白特异性免疫沉淀达到富集的某种特定 DNA 序列的数量 (1,2)。或者,ChIP 测定法还可与基因组微芯片(芯片上的 ChIP)技术、高通测序或克隆策略联合使用,它们都能对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组分析 (5-8)。

  1. Orlando, V. (2000) Trends Biochem Sci 25, 99-104.
  2. Kuo, M.H. and Allis, C.D. (1999) Methods 19, 425-33.
  3. Agalioti, T. et al. (2000) Cell 103, 667-78.
  4. Soutoglou, E. and Talianidis, I. (2002) Science 295, 1901-4.
  5. Mikkelsen, T.S. et al. (2007) Nature 448, 553-60.
  6. Lee, T.I. et al. (2006) Cell 125, 301-13.
  7. Weinmann, A.S. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 37-47.
  8. Wells, J. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 48-56.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
SimpleChIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
AMPure 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标
Bioanalyzer 是 Agilent Technologies, Inc 的注册商标
Illumina 是 Illumina, Inc 的注册商标。
Q5 是 New England Biolabs, Inc. 的注册商标
SPRIselect 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标
USER Enzyme 是 New England Biolabs, Inc. 的注册商标

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