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SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®
ChIP 试剂盒与试剂

SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795

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筛选器:
  1. ChIP

使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 对 4 x 106 个 HCT 116 细胞的交联染色质和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng 富集的 ChIP DNA 或 50 ng 输入 DNA 制成 DNA 库,DNA 库合成一份样品,并在 Illumina® Next-Seq 平台上进行测序。结果图显示在 GAPDH 内结合,GAPDH 是 H3K4me3 的一种已知靶基因。如需了解其他 ChIP-seq 情况,请下载产品说明书。

使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 对 4 x 106 个 HCT 116 细胞的交联染色质和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng 富集的 ChIP DNA 或 50 ng 输入 DNA 制成 DNA 库,DNA 库合成一份样品,并在 Illumina® Next-Seq 平台上进行测序。结果图显示在 CaMK2D 内结合,CaMK2D 是 TCF4/TCF7L2 的一种已知靶基因。如需了解其他 ChIP-seq 情况,请下载产品说明书。

对使用不同数量的起始 ChIP DNA 生成的 ChIP-seq 数据进行集合基因分析。对 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(左图)和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569(右图)ChIP-seq 数据进行的分析表明,在全基因组中发现的波峰处信噪比与所有三种起始数量的 ChIP DNA 均相似。

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56795S
1 个试剂盒(24 次实验)

产品包括 容量(计数) 保存温度
End Prep Enzyme Mix 1 x 72 µl -20°C
End Prep Reaction Buffer 1 x 168 µl -20°C
Ligation Enhancer 1 x 24 µl -20°C
Ligation Master Mix 1 x 720 µl -20°C
Q5® PCR Master Mix 1 x 600 µl -20°C

存储:

所有组分都保存在 -20ºC 下。如果正确保存,本产品可保持稳定 12 个月。

实验步骤

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ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种高通量方法,可在染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测的下游用来检测和定量全基因组中的靶标 DNA 富集度。SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® 含有在 Illumina® 平台上使用 ChIP DNA 进行下一代测序分析来产生高质量 DNA 测序库所必需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。

每一个试剂盒组分都必须通过严格的质控标准,并且对于每一个新批次,都在 Illumina® 测序平台上通过构建和测序有索引的库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品必须与 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 结合使用。本产品包含的试剂量足以进行 24 次反应,并且适合酶解和超声处理碎裂的 ChIP 富集的 DNA。

适合的 SimpleChIP® 试剂盒:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003、
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383、
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 和
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538

不适合的 SimpleChIP® 试剂盒:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004。
注:琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA,这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需试剂
试剂包括:

  1. (绿色)End Prep Enzyme Mix #73416
  2. (绿色)End Prep Reaction Buffer #93209
  3. (红色)Ligation Master Mix #46719
  4. (红色)Ligation Enhancer #30147
  5. (蓝色)Q5® PCR Master Mix (2X) #67488

未包括的试剂:

  1. SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect® Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80% 乙醇(新鲜制备)
  5. 1X TE(10 mM Tris-HCl,pH 为 8.0,1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5)
  7. 磁力架/支架
  8. Bioanalyzer® 和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR 仪器

一. 结束制备

进行 ChIP-seq 时,必须生成一个对照 DNA 测序库,用于确定在 ChIP 分析和 DNA 库制备过程中引起的 DNA 富集是否有任何实验偏差。用输入染色质(即用于进行免疫沉淀的染色质)纯化的 DNA 通常用来生成对照 DNA 库。起始原料: 500pg – 1 μg ChIP DNA。为确保 DNA 测序库的最佳多样性,我们建议在转录因子和辅助因子 ChIP-seq 中使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA,在总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq 中使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA,在对照 DNA 测序库中使用 50 ng 输入 DNA。如有必要,在库的生成中使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA,但由于扩增过程中存在 PCR 偏差,这可能会导致库的多样性程度较低。开始之前:

  • 在室温下解冻 End Prep Enzyme Mix (•)
  • 制备 1X TE(10 mM Tris-HCl,pH 为 8.0,1 mM EDTA)。
  1. 用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA(对照 DNA)。添加 1X TE,让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
  2. 往每份 DNA 样品中添加 3 μl End Prep Enzyme Mix () 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (),使总反应体积为 60 μl。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物,并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 放在热循环仪中,并进行以下流程:
    • 在 20 °C 下保存 30 分钟
    • 在 65 °C 下保存 30 分钟
    • 保持在 4 °C 下
  5. 继续进行接头蛋白连接(第二部分)。如有必要,将样品保存在 -20°C 下,但可能会观察到少量产率损失(约 20%)。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

II. 接头蛋白连接

在开始之前:

  • Adaptor for Illumina® () 和 USER enzyme () 均可在 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 中被发现。
  • 在室温下解冻 Adaptor for Illumina® ()。
  • 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
  • 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5)。
  1. 将 Adaptor for Illumina® () 在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释。如果起始 DNA 为 5 ng 至 100 ng,则以 1:10 的比例稀释接头蛋白,以产生 1.5 mM 的使用浓度。如果起始 DNA 少于 5 ng,则以 1:25 的比例稀释接头蛋白,以产生 0.6 mM 的使用浓度。
  2. 将 30 μl Ligation Master Mix ()、1 μl Ligation Enhancer () 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina® 直接加入到 60 μl End Prep Reaction Mixture(源于第一部分的步骤 5)中。
    注:不建议提前制备含有稀释的接头蛋白的反应预混物。
  3. 上下吹打至少 10 次以彻底混合连接反应物,并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合,因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
  4. 在室温下孵育 15 分钟。
  5. 添加 3 μl USER Enzyme () 到连接混合物中。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟,加热盖设置为 ≥ 47°C。
  6. 继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA(第三部分)。(安全停止)或者,将样品保存在 -20°C 下,过夜。

三、清除接头蛋白连接的 ChIP DNA,无需进行大小选择。

在清除接头蛋白连接的 ChIP DNA 的阶段,不建议进行大小选择,因为它会导致 ChIP-seq DNA 库的产率和多样性急剧下降。

在开始之前:

  • 如果用 AMPure® XP beads,则在使用前至少 30 分钟先将磁珠加热至室温。
  • 涡旋 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® beads 以进行重悬。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5)。
  1. 添加 87 μl (0.9X) 重悬后的 AMPure® XP beads 或 SPRIselect® beads 到每份接头蛋白连接反应物中。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中,注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上,样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟,以让磁珠与上清液分离。
  4. 一旦溶液变澄清,便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时,将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒,随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次,共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上,且盖子保持打开时,让磁珠风干长达 5 分钟。注:请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑,但所有可见液体均已蒸发时,洗脱样品。如果磁珠开始破裂,则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5),以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上,等待 5 分钟。一旦溶液变澄清,便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集(第四部分)。(安全停止)或者,将样品保存在 -20°C 下。

四、对接头蛋白连接的 ChIP DNA 进行 PCR 富集

在开始之前:

  • SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 中包含 Universal PCR Primer for Illumina® () 和十二份 Index Primers for Illumina® ()。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用,则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表,了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 中包含八份 Index 5 Primers for Illumina®(白色盖子)和十二份 Index 7 Primers for Illumina®(橙色盖子)。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用,则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表,了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
  • 在室温下解冻引物和纯化的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段(源于第三部分中的步骤 9)。
  1. 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中:
    试剂 1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
    纯化后的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段(源于第三部分中的步骤 9) 15 μl
    Q5® PCR Master Mix () 25 μl
    Single Index Primer for Illumina® ()(或编入双重索的 Dual Index 7 Primer for Illumina® [橙色盖子]) 5 μl
    Universal PCR Primer for Illumina® (•)(或编入双重索引的 Dual Index 5 Primer for Illumina® [白色盖子]) 5 μl
  2. 上下吹打 10 次以彻底混合反应物,并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。
  3. 将试管放在热循环仪上,并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增:
    a. 初始变性 98°C 30 秒
    b. 变性 98°C 10 秒
    c. 退火和延伸 65°C 75 秒
    d.

    如果起始原料为 50 ng ChIP DNA,则重复步骤 b 和 c,共循环 6 次。如果起始原料为 5 ng ChIP DNA,则重复步骤 b 和 c,共循环 10 次。如果起始原料为 0.5 ng ChIP DNA,则重复步骤 b 和 c,共循环 13 次。

    e. 终末延伸 65°C 5 分钟
    f. 保持 4°C
  4. 继续清除 PCR 扩增物(第五部分)。(安全停止)或者,将样品保存在 -20°C 下。

五、清除 PCR 扩增物

在开始之前:

  • 如果用 AMPure® XP beads,则在使用前至少 30 分钟先将磁珠加热至室温。
  • 涡旋 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® beads 以进行重悬。
  • 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
  • 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5)。
  1. 将 45 μl (0.9X) 重悬后的 AMPure® XP beads 或 SPRIselect® beads 添加到 50 μl 在第四部分步骤 4 中制备的 PCR 反应物中。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中,注意将所有液体排出吸头。
  2. 在实验台上,样品在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟,以让磁珠与上清液分离。
  4. 小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  5. 在将试管/平板放在磁力架中时,将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒,随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
  6. 重复步骤 5 一次,共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
  7. 在将试管/平板放在磁力架上,且盖子保持打开时,让磁珠风干长达 5 分钟。注:请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑,但所有可见液体均已蒸发时,洗脱样品。如果磁珠开始破裂,则说明磁珠太干燥。
  8. 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl(pH 为 8.0-8.5),以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
  9. 将试管/平板放在磁力架上,等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。(安全停止)可将库保存在 -20°C 下。
  10. 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
  11. 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明,用 Agilent Bioanalyzer® High Sensitivity DNA 芯片来确定稀释后 DNA 库的大小分布。
  12. 如果观察到接头蛋白二聚物(Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp)污染,则重复清除步骤 1-10。残留的接头蛋白和/或接头蛋白二聚物会严重污染测序反应
  13. 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品,以进行高通量测序。请参阅 Illumina® 测序手册,了解 NG-seq 所需的 DNA 库的最佳浓度和体积。

附录 A:样品结果

50 ng 5 ng 0.5 ng 50 ng 输入 DNA

图 1. 使用通过 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 产生的不同起始数量的 ChIP DNA 制成的 DNA 库在 Agilent Bioanalyzer® 上的特征。DNA 库用 50 ng、5 ng 或 0.5 ng 富集的 ChIP DNA 和 50 ng 输入 DNA 制成。如图所示,每次 DNA 库的制备均表明 DNA 片段大小相似(预期范围为 300 bp 至 900 bp)。

库生成量 (ng) 总读取次数(百万) 比对至基因组的读取次数 (%) 发现的波峰数
TCF4/TCF7L2 #2569 (50 ng) 140.8 39.8 97.8 9425
TCF4/TCF7L2 #2569 (5 ng) 187.8 34.4 97.8 10506
TCF4/TCF7L2 #2569 (0.5 ng) 67.3 33.7 96.0 9416
H3K4me3 #9751 (50 ng) 110.7 29.4 98.5 27967
H3K4me3 #9751 (5 ng) 120.5 33.7 98.2 28665
H3K4me3 #9751 (0.5 ng) 44.2 29.4 94.1 32221
输入 DNA (50 ng) 112.2 26.8 97.9 N/A

表 1. 比较使用通过 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 生成的不同起始量的 ChIP DNA 制备的 DNA 测序库。使用 4 x 106 个 HCT 116 细胞与 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 或 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 ChIP。使用 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 中包含的双索引引物制成库,所有的库合成一份样品,并在 Illumina® Next-Seq 平台上进行测序。如图所示,对于所有三种起始数量的 ChIP DNA,发现的波峰数均相似。


图 2. 使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和不同起始量的 ChIP DNA 生成的 ChIP-seq 数据,如表 1 所述。结果图显示在染色体 12(上小图)内的结合,包括 H3K4me3 的已知靶基因 GAPDH(下小图)。如图所示,对于所有三个起始量的 ChIP DNA,峰型和峰高均相似。


图 3. 使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 生成的 ChIP-seq 数据,如表 1 所述。结果图显示在染色体 4(上小图)内的结合,包括 TCF4/TCF7L2 的已知靶基因 CaMK2D(下小图)。如图所示,对于所有三个起始量的 ChIP DNA,峰型和峰高均相似。


图 4. 对使用不同数量的起始 ChIP DNA 生成的 ChIP-seq 数据进行集合基因分析。对 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(左小图)和 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569(右小图)ChIP-seq 数据进行的分析表明,对于所有三个起始量的 ChIP DNA,全基因组中发现的波峰处信噪比相似。

附录 B:试剂盒组分的质量控制

一. End Prep Enzyme Mix ()

说明
End Prep Enzyme Mix 经优化后可将 500 pg-1 μg 碎裂的 DNA 转化为具有 5´-磷酸化、3´-dA 尾端的已修复 DNA。

质量控制检测

  1. SDS-PAGE 纯度:对每个单独的酶进行的 SDS-PAGE 分析显示,酶纯度 > 95%。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入至少 10 μl 这种酶混合物和 1 μg φX174 RF I DNA,并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入至少 10 μl 这种酶混合物,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
  4. 功能活性(核苷酸聚合、磷酸化和 dA 拖尾):在 1X End Repair Reaction 缓冲液中加入 1 μl 这种酶混合物,在 25°C 下孵育 20 分钟,经毛细管电泳确定,可修复和磷酸化 0.5 μg 含 3´ 和 5´ 突出端的 DNA 片段的 > 95% 末端。

II. End Prep Reaction Buffer ()

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg φX174 RF I DNA,并在 37°C 下孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性:将 1X 反应缓冲液和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时,经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入 1X 反应缓冲液,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

三、Ligation Master Mix ()

说明
Ligation Master Mix 是一种即用型解决方案,包含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强子以及优化的反应缓冲液。

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 50 μl 反应体积中加入 1X Ligation Master Mix 和 1 μg φX174 RF I DNA,并在 37°C 下孵育 4 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性:将 1X Ligation Master Mix 和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时,经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 转化检测:LITMUS™ 28 载体用 EcoRV(钝性)切割,用牛小肠磷酸酶处理,并用凝胶纯化。使用 Ligation Master Mix 实验步骤,将 HaeIII 酶切 φX174 DNA 产生的钝性插入物以 3:1(插入物:载体)的比例连接在载体中。连接产物按之前所述转化。每一批均超过以下标准:

效率(转化物/µg)

重新环化 插入
钝端 > 1 x 107 > 2.5 x 106
未切割的载体 > 1 x 108 N/A

四、Ligation Enhancer ()

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μl NEBNext 5´ SR Adaptor 3 和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也无可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性:在 4 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋 DNA,并在 37°C 下孵育 50 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II(带切口的分子)的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性:在 10 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 40 ng RNA 转录物,并在 37°C 下孵育 16 小时,经凝胶电泳确定没有可检测的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入 1 μl Ligation Enhancer,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

五. Q5® PCR Master Mix (2X) ()

说明
Q5® PCR Master Mix (2X) 专门优化用于实现下一代测序分析 (NGS) 库的可靠、高精度扩增,无论 GC 的含量如何。主混合物的聚合酶组分 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 是一种新型的 DNA 耐热聚合酶,它具有 3´→5´ 核酸外切酶活性,可融合至一个持续合成能力增强的 Sso7d 结构域。Q5 的错误率也超低(比 Taq DNA 聚合酶的错误率要低 100 倍以上,比强烈火球菌 (Pfu) DNA 聚合酶要低大约 12 倍)。主混合物的缓冲液组分经优化可用于实现可靠扩增,即便是含有 GC 富集的扩增子的情况,并且对各种用于典型 NGS 工作流程的珠子具有更高的适用性。这些特性使得 Q5® PCR Master Mix 非常适合用于进行 NGS 库构建。这种便利的 2X 主混合物包含 dNTPs、Mg++ 以及专有缓冲液,并且仅需添加引物和 DNA 模板即可进行可靠扩增。内含热启动适配子,可方便进行室温反应设置。

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育:在 50 μl 反应体积中加入 Q5® PCR Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 Q5® PCR Master Mix 和 1 μg T3 DNA,并在 37°C 下孵育 16 小时,经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 磷酸酶活性:在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液(1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2)中加入 Q5® PCR Master Mix,在 37°C 下孵育 4 小时,经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
  3. 功能活性(多重 PCR,磁珠抑制):在含有 0.5 μM 4-plex primer mix 和 1X Q5® PCR Master Mix 的 50 μl 反应体积中,使用和不使用羧化磁珠对 20 ng 基因组 DNA 进行 30 次 PCR 扩增循环,结果表明在添加磁珠的情况下会出现四个预期扩增子,但不会抑制扩增。

发布​于 2017 年 11 月 

实验步骤编号:1624

实验步骤编号:1624

产品说明

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种高通量方法,可在染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测的下游用来检测和定量全基因组中的靶标 DNA 富集度。SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® 含有在 Illumina® 平台上使用 ChIP DNA 进行下一代测序分析来产生高质量 DNA 测序库所必需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。本产品必须与 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 结合使用。

本产品包含的试剂量足以进行 24 次反应,并且适合酶解和超声处理碎裂的 ChIP 富集的 DNA。本产品适合 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003、SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 和 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383。该产品不适合 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 和 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004,因为琼脂糖微珠会封阻经超声处理的鲑鱼精 DNA,这会污染 DNA 库制备和 NG-seq。

特异性/敏感性

该试剂盒经验证可与 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 结合使用,以将 50 ng、5 ng 或 0.5 ng ChIP DNA 用作起始物质来产生合格的 DNA 库。使用不同起始量的 ChIP DNA 制备的库显示,Bioanalyzer® 特征、基因组比对率、发现的结合波峰数量以及全基因组信噪比均相似。

背景

染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法是一种用于在细胞天然染色质背景下探测蛋白质-DNA 相互作用的强大的通用技术 (1,2)。这种测定法用于检测与基因组某个特定区域有关的多种蛋白,或相反,用于检测某种特殊蛋白结合的基因组的多个区域 (3-6)。它可用于确定各种蛋白被募集到某个基因启动子上的特定顺序,或用于“测定”整个基因位点上某种特定组蛋白修饰的相对数量 (3,4)。除了组蛋白外,ChIP 测定法还可用于分析转录因子与辅助因子、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合。进行 ChIP 检测时,细胞或组织首先用甲醛固定,甲醛是一种可逆的蛋白-DNA 交联剂,可“维持”细胞中发生的蛋白-DNA 相互作用 (1,2)。细胞进行裂解,染色质采集后使用超声处理或酶消化法进行碎裂。染色质随后使用对某种特殊蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体进行免疫沉淀。任何与目标蛋白或组蛋白修饰有关的 DNA 序列都会作为交联染色质复合体的一部分进行共沉淀,并且该 DNA 序列的相对数量会在免疫选择过程中达到富集。免疫沉淀后,蛋白质-DNA 交联被逆转,DNA 得以纯化。标准 PCR 或定量实时 PCR 用于测量通过蛋白特异性免疫沉淀达到富集的某种特定 DNA 序列的数量 (1,2)。或者,ChIP 测定法还可与基因组微芯片(芯片上的 ChIP)技术、高通测序或克隆策略联合使用,它们都能对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组分析 (5-8)。

  1. Orlando, V. (2000) Trends Biochem Sci 25, 99-104.
  2. Kuo, M.H. and Allis, C.D. (1999) Methods 19, 425-33.
  3. Agalioti, T. et al. (2000) Cell 103, 667-78.
  4. Soutoglou, E. and Talianidis, I. (2002) Science 295, 1901-4.
  5. Mikkelsen, T.S. et al. (2007) Nature 448, 553-60.
  6. Lee, T.I. et al. (2006) Cell 125, 301-13.
  7. Weinmann, A.S. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 37-47.
  8. Wells, J. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 48-56.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
SimpleChIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
AMPure 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标
Bioanalyzer 是 Agilent Technologies, Inc 的注册商标
Illumina 是 Illumina, Inc 的注册商标。
Q5 是 New England Biolabs, Inc. 的注册商标
SPRIselect 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标
USER Enzyme 是 New England Biolabs, Inc. 的注册商标

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