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4360
Cyclic GMP XP® Assay Kit
细胞检测试剂盒

Cyclic GMP XP® Assay Kit #4360

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图 2:RFL-6 细胞用硝普钠 (SNP) 处理会导致 cGMP 浓度升高,使用 Cyclic GMP XP® Assay Kit #4360 可进行检测。RFL-6 细胞按 2x105 个细胞/孔放在 12 孔板上进行培养,并孵育过夜。细胞不用处理或用 0.5 mM IBMX 预处理 15 分钟,随后进行 SNP 处理(30 分钟)并用 1X Cell Lysis Buffer #9803 进行裂解。吸光度值(左图)和活性百分比(右图)如上所示。活性百分比按照以下公式计算:% 活性 = 100x [(A-A本底)/(A最大-A本底)],其中 A 为样品吸光度,A最大为最大刺激(即高 SNP 浓度)时的吸光度,A 本底为在本底水平(无 SNP)时的吸光度。SNP 是一种一氧化氮供体,能直接激活可溶性鸟苷酸环化酶并使细胞 cGMP 浓度升高。IBMX 是 cAMP 和 cGMP 磷酸二酯酶的一种非特异性抑制剂,能促进 cAMP 和 cGMP 在细胞中聚集。

图 3:RFL-6 细胞用房钠肽 (ANP) 处理会导致 cGMP 浓度升高,使用 Cyclic GMP XP® Assay Kit #4360 可进行检测。RFL-6 细胞按 2x105 个细胞/孔放在 12 孔板上进行培养,并孵育过夜。细胞未经处理或用 0.5 mM IBMX 预处理 15 分钟,随后进行 ANP 处理(30 分钟)并用 1X Cell Lysis Buffer #9803 进行裂解。吸光度值(左图)和活性百分比(右图)如上所示。活性百分比按照以下公式计算:% 活性 = 100x [(A-A本底)/(A最大-A本底)],其中 A 为样品吸光度,A最大为最大刺激(即高 ANP 浓度)时的吸光度,A 本底为在本底水平(无 ANP)时的吸光度。ANP 是一种配体,能结合并激活膜结合的鸟苷酸环化酶,从而使细胞 cGMP 浓度升高。

图 1:cGMP 标准液用 1X Cell Lysis Buffer #9803 稀释,并且样品遵照 Cyclic GMP XP® Assay Kit 实验步骤进行检测。该标准曲线仅用作演示目的;用户应为每个样品组(的测定)建立标准曲线,以准确确定 cGMP 浓度。

购买 # 4360S
产品货号 规格 价格 库存
4360S
1 个试剂盒(96 次检测)

产品包括 数量(计数) 溶液颜色
cGMP Rabbit mAb Coated Microwells 1 x 96 次检测
cGMP-HRP Conjugate 1 x 11 ml 红色
cGMP Standard (5 uM) 1 x 1 ml
TMB Substrate 7004 1 x 11 ml
STOP Solution 7002 1 x 11 ml
Sealing Tape 1 x 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 1 x 10 ml
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 1 x 15 ml

实验步骤

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酶免疫检测实验步骤

A. 试剂制备

  1. 使用前,让全部微孔板条达到室温。
  2. 通过在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 20 X 洗涤缓冲液(包含于每个试剂盒中),制备 1 X 洗涤缓冲液。
  3. 在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 10 X Cell Lysis Buffer #9803 至 1 X。应当每次现添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用(1–2 周)。

B 细胞裂解物制备

注意:该步骤适用于 96 孔组织培养平板。可以在对其修改后用于其他组织培养板(6、12、24 或 48 孔)。

  1. 将目的细胞铺种于 96 孔板中(一般在 6–100 X 103个细胞/孔之间)并且在适宜的细胞培养条件下孵育过夜
  2. 用 200 µl 温暖的 PBS 润洗细胞,随后在无血清培养基中添加测试化合物并且将细胞孵育所需时间段。
  3. 用 200 µl 冰冷的 PBS 润洗细胞 2 次,并且随后添加 100μl/孔 1 X 裂解缓冲液,于冰上放置 510 分钟。

注意:如果观察到细胞碎片,可以通过短暂离心分离平板来去除,并将澄清的裂解物转移到新的 96 孔板上。

C. 测定

  1. 让全部试剂盒组分达到室温。
  2. 添加 50 µl HRP 连接的靶标溶液和 50μl 样品至抗体包被的分析平板。盖住平板并且在水平圆周式平板摇床上室温孵育 3 小时。
  3. 弃去平板内容物并用 200μl/孔 1 X 洗涤缓冲液洗涤各孔 4 次。确保每次洗涤后弃去全部液体,但不应让孔完全干燥。
  4. 添加 100μl TMB Substrate。
  5. 在室温孵育 30 分钟。

注意:观察是否显色,因为可能需要在 30 分钟前停止反应。

  1. 添加 100μl STOP Solution。
  2. 测量吸光度在 450 nm(为得到最佳结果,在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取平板)。

注意:为了确定检测物质的绝对量,需要每次都建立标准曲线。请遵循产品数据表上的详细实验步骤以确定标准曲线的浓度范围。

发布​于 2010 年 4 月 

实验步骤编号:68

产品说明

Cyclic GMP XP® Assay Kit 是一种用于确定目标细胞或组织中 cGMP 水平的竞争性酶联免疫检测试剂盒。在该测定中,检测样品中的 cGMP 与固定量的 HRP 标记cGMP 竞争性结合固定在 96 孔板上的 anti-cGMP XP® Rabbit mAb。洗涤并去除样品中多余的 cGMP 和 HRP 标记的 cGMP 后,加入 HRP 底物 TMB 来显色。鉴于该检测的竞争性质,该显色的吸光度值与样品 cGMP 的数量成反比。使用 cGMP 标准液测量吸光度,以计算某种目标样品中 cGMP 的绝对量。

注意:12 8 孔模型 - 每个模型可分开用于 8 次检测。

特异性/敏感性

测试该试剂盒对以下物质的免疫反应性:ADP、AMP、ATP、cAMP、cGMP、cIMP、cTMP、CTP、GDP、GMP 和 GTP。观察到与 cIMP 具有轻微的交叉反应性,与 cIMP 相比,对 cGMP 的敏感性高出 100 多倍。未观察到与任何其他检测因子具有交叉反应性。如图 1 所示,试剂盒敏感性的动态范围为 2 - 200 nM cGMP。特殊处理后的细胞 cGMP 水平变化如图 2 和图 3(低通道 RFL-6 细胞)所示。

物种反应性:

预期的所有物种

背景

环鸟苷酸 3’,5’-单磷酸 (cGMP) 是一种关键的多功能第二信使分子,与几乎所有物种中不同细胞类型的许多信号转导通路有关 (1)。胞内 cGMP 通过鸟苷酸环化酶 (GC) 由 GTP 产生,并通过磷酸二酯酶 (PDE) 水解被降解 (1,2)。现已发现两个不同的 GC 家族:对一氧化氮有反应且可结合细胞膜的可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC);对肽类激素、细菌毒素和自由基等不同胞外激动剂有反应的颗粒状鸟苷酸环化酶 (pGC) (2,3)。磷酸二酯酶会形成一个由 11 种同工型构成的超家族,对环核苷酸 3’,5’-单磷酸 (cAMP) 和 cGMP 具有不同的特异性 (4)。环 GMP 会通过激活 cGMP 依赖性激酶,调控 cGMP 依赖性离子通道或转运蛋白并改变自身的磷酸二酯酶 (PDE) 水解降解来调节细胞生理机能 (1,4)。鉴于其效应子的多样性,cGMP 在血管平滑肌运动、小肠液、电解质平衡和视网膜光传导等不同病理和生理进程的调控中发挥重要作用 (1,5)。

  1. Domek-Łopacińska, K. and Strosznajder, J.B. (2005) J Physiol Pharmacol 56 Suppl 2, 15-34.
  2. Lucas, K.A. et al. (2000) Pharmacol Rev 52, 375-414.
  3. Potter, L.R. et al. (2006) Endocr Rev 27, 47-72.
  4. Matsumoto, T. et al. (2003) J Smooth Muscle Res 39, 67-86.
  5. Rybalkin, S.D. et al. (2003) Circ Res 93, 280-91.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。

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