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5723
Caspase-3 Activity Assay Kit
细胞检测试剂盒

Caspase-3 Activity Assay Kit #5723

引用 (2)

图 1. NIH/3T3 细胞用 Staurosporine #9953(5 μM,5 小时)处理,随后在 PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018(试剂盒中提供)中进行裂解。添加不同量的细胞裂解物到含有底物溶液的检测平板上,并在 37ºC 下将平板放在阴暗处进行孵育。分别在 1 小时和 4 小时时获得相对荧光单位 (RFU)。

图 2. NIH/3T3 细胞按 1x10 5 个细胞/孔或 5x104 个细胞/孔的密度在 96 孔板中培养,随后用 Staurosporine #9953(5 μM,5 小时)处理,并在 30 μl PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018(试剂盒中提供)中进行裂解。添加细胞裂解物到含有底物溶液的检测平板上,并在 37ºC 下将平板放在阴暗处进行孵育。分别在 0、1、2、4和 6 小时时获得相对荧光单位 (RFU)。

图 3. Hela 细胞按 1x105 个细胞/孔的密度在 96 孔板中培养,并孵育过夜。细胞用不同浓度的 Staurosporine #9953(5 小时)处理,随后在 30 μL PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018(试剂盒中提供)中进行裂解。细胞裂解物与底物溶液一起混合,并在 37ºC 下放在阴暗处孵育 2 小时,以获得相对荧光单位 (RFU)。

购买 # 5723S
产品货号 规格 价格 库存
5723S
1 个试剂盒(200 次检测)

产品包括 数量(计数)
Ac-DEVD-AMC 1 x 1 mg
AMC (7-amino-4-methylcoumarin) 1 x 250 µl
PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) 7018 1 x 30 ml
Caspase Assay Buffer (2x) 1 x 30 ml
DTT (Dithiothreitol) 7016 1 x 192.8 mg

实验步骤

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Caspase-3 Activity Assay Kit 实验步骤

A. 试剂制备

  1. 在 1 ml DMSO 中重新配制 Ac-DEVD-AMC。
  2. 冻试剂解冻后应立即用于进行试验(DTT、Ac-DEVD-AMC)。

注意:试剂保存在 -20°C 下时可能会发生沉淀。如有必要,加热试剂到 37°C 以溶解沉淀物。

  1. 将一部分检测缓冲液 (2X) 与一部分 dH2O 混合,并添加 DTT(1:200 的稀释比例,最终浓度为 5 mM)来制备 1X 检测缓冲液 A
  2. 将 Ac-DEVD-AMC(1:40 的稀释比)稀释在 1X 检测缓冲液 A 中,以制备底物溶液 B

B. 细胞裂解物制备:从 96 孔培养板中收集裂解物

  1. 1. 将细胞放在 96 孔板上,并用相应的检测物质按适当时间进行孵育。一般的细胞数为 5x104 – 2x105 个细胞/孔。
  2. 处理后,以 300xg 的离心力旋转培养板 10 分钟,清除培养基,细胞用冰冷的 PBS 漂洗,以 300xg 的离心力旋转培养板 10 分钟,清除 PBS。
  3. 每孔添加 30 μl 细胞裂解缓冲液 (#7018),并将培养板放在冰上 5 分钟。

注:细胞裂解物培养板可保存在 −80°C 下供日后使用。

从皮氏培养皿上收集裂解物:

  1. 处理后,检查细胞的贴壁性。如果细胞从培养板上分离或仅松散被吸附在培养板上,则继续执行步骤 b;如果细胞被紧紧吸附在培养板上,则继续执行步骤 c。
  2. 培养板用现有培养基漂洗,以便将所有细胞收集放入离心管中。以 1000g cpm 的离心力旋转 5 分钟,清除上清液并将细胞裂解缓冲液 (#7018)(0.5 ml/10 cm 培养板)添加到细胞沉淀物。上下吹打几次以使细胞分散开。放在冰上并继续执行步骤 d。
  3. 细胞用冰冷的 PBS 漂洗,随后往培养板添加细胞裂解缓冲液 (#7018)(0.5 ml/10 cm 培养板),培养板放在冰上 5 分钟。从平板刮下细胞并转移至适当的试管。放在冰上并继续执行步骤 d。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 下微量离心分离 10 分钟,并将上清液转移到一根试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 半胱天冬酶活性检测

  1. 1X 检测缓冲液 A 中将细胞裂解物稀释至所需浓度(建议 0.5–4 mg/ml)。如果细胞裂解物来自 96 孔板,则无需进行稀释。
  2. (可选)将 25 µl 阳性对照 AMC(随试剂盒提供)与 200 μl 1X 检测缓冲液 A 混合以作为阳性对照。
  3. 在适合用于荧光检测的黑色培养板上,将 200 µl 底物溶液 B 和 25 µl 裂解物溶液混合在一起。

注:我们建议立即读取培养板,并记录 0 小时处的 RFU 读数。这将有助于确定在孵育结束时 RFU 是否发生明显变化。

注:该实验步骤已经在 384 孔培养板样式中进行了测试,请根据培养板容量按比例调整容量。例如,如果使用 384 小容量培养板,则使用 20 µl 底物溶液 B 和 2.5 µl 裂解物。

  1. 在 37°C 下,培养板放在阴暗处孵育。
  2. 使用 380 nm 的激发波长和 420–460 nm 的发射波长读取荧光读板机上的 RFU。

注:孵育 1 小时后,我们建议读取培养板。如果信号太弱,则延长孵育时间,以观察信号强度是否发生明显变化。如果未观察到信号强度明显增强,则需要加入更多裂解物。

发布​于 2012 年 10 月 

实验步骤编号:74

产品说明

Caspase-3 Activity Assay Kit 是一种可识别细胞裂解物中 caspase-3 活性的荧光检测试剂盒。它包含 caspase-3 的一种荧光底物(N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-氨基-4-甲基香豆素或 Ac-DEVD-AMC)。在检测过程中,活化的 caspase-3 可裂解在 DEVD 和 AMC 之间的该底物,会产生强荧光 AMC,使用激发光为 380 nm 且发射光为 420-460 nm 的荧光读取器可检测。该底物的裂解活化仅发生在凋亡细胞的裂解物中,因此,AMC 产生的量与样品中凋亡细胞的数量成比例。

特异性/敏感性

Caspase-3 Activity Assay Kit 可识别凋亡细胞中活化 caspase-3 裂解 Ac-DEVD-AMC 所产生的 AMC 荧光染料。该试剂盒预计在多数物种中均会起作用。根据检测中所使用的细胞类型和孵育时间,0.5 - 2x105 个细胞/孔(或100 μg 总裂解物蛋白/孔)对多数实验计划即可。要获得最佳结果,建议进行细胞数目或裂解物浓度滴定(见图 1 和 2)。caspase-7 的底物序列与 caspase-3 相同,因此该试剂盒还可检测caspase-7 活性。

背景

Caspase-3 (CPP-32, Apoptain, Yama, SCA-1) 是一个凋亡的关键执行者,因为它对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用,比如核酶多聚 (ADP-ribose) 聚合酶 (PARP) (1)。caspase-3 的激活需要经过其未活化的酶原形式转变为活化的 p17 和 p12 片段的蛋白水解过程。caspase-3 的剪切需要位于 P1 位点的天门冬氨酸残基 (2)。

Caspase-7(CMH-1、Mch3、ICE-LAP3)被发现会主要导致细胞凋亡的执行 (3-6)。与 caspase-3 一样,caspase-7 是一种效应子 caspase ,负责裂解活化下游底物,如 PARP (3,5)。在细胞凋亡期间,caspase-7 通过 Asp23、Asp198 和 Asp206 蛋白水解加工被上游 caspase 激活,从而产生成熟亚基 (3,5)。与 caspase-2 和 -3 相似,caspase-7 在识别序列 DEVD 后优先裂解活化底物 (7)。

  1. Fernandes-Alnemri, T. et al. (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.
  2. Nicholson, D.W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.
  3. Cohen, G.M. (1997) Biochem J 326 ( Pt 1), 1-16.
  4. Thornberry, N.A. et al. (1997) J Biol Chem 272, 17907-11.
  5. Fernandes-Alnemri, T. et al. (1995) Cancer Res 55, 6045-52.
  6. Duan, H. et al. (1996) J Biol Chem 271, 1621-5.
  7. Lippke, J.A. et al. (1996) J Biol Chem 271, 1825-8.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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