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8821
Active Ras Detection Kit
细胞检测试剂盒

Active Ras Detection Kit #8821

免疫印迹法图像 1

图 1. NIH/3T3 细胞裂解物(500 µl,1 mg/ml)在体外用 GTPγS 或 GDP 处理会使 Ras 激活或失活(参阅实验步骤中的可选步骤 C)。裂解物随后与谷胱甘肽树脂和 GST-Raf1-RBD(泳道 2 和 3)进行孵育。以谷胱甘肽树脂作为阴性对照(泳道 4),已经 GTPγS 处理的裂解物,在不含GST-Raf1-RBD的情况下,也进行孵育。使用 Ras mouse mAb 对细胞裂解物(20 µg,泳道 1)或 20 µl 洗脱样品(泳道 2、3 和 4)进行蛋白质印迹分析。Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 用作二抗。

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原理图像2

图 2. 如图所示,GTP 结合 GTP 酶沉淀过程可分为 3 个步骤。第 1 步:在旋转杯中混合样品、结合蛋白和谷胱甘肽树脂,并在 4ºC 下孵育,以使 GTP 结合的 GTP 酶通过 GST 连接的结合蛋白与谷胱甘肽树脂结合。第 2 步:通过离心分离去除未结合的蛋白。第 3 步:用 SDS 缓冲液洗脱结合谷胱甘肽树脂的 GTP 酶。洗脱样品随后通过蛋白质印迹实验进行分析。

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产品包括 数量(计数) 保存温度
GTP γS 1 x 50 µl -80°C
GDP 1 x 50 µl -80°C
Glutathione Resin 1 x 3 ml 4°C
Lysis/Binding/Wash Buffer 1 x 100 ml 4°C
SDS Sample Buffer 1 x 1.5 ml 4°C
Spin Cup and Collection Tubes 1 x 30 ea 4°C
GST-Raf1-RBD 1 x 2.4 mg -80°C
Ras Mouse mAb 1 x 250 µl 4°C

Active Ras Detection Kit 提供了检测细胞中Ras GTP 酶活化所必需的所有试剂。GST-Raf1-RBD 融合蛋白用于结合活化形式的 GTP 结合 Ras,GTP 结合 Ras 随后可用谷胱甘肽树脂进行免疫沉淀。随后使用 Ras mouse mAb 进行蛋白质印迹实验来确定 Ras 激活水平。

Active Ras Detection Kit 可检测内源水平的 GTP 结合(活化)Ras,如图 1 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

小 GTP 结合蛋白(G 蛋白)Ras 超家族包含一大类蛋白(超过 150 个成员),根据它们的序列和功能相似性,可分为至少五个家族:Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran (1-3)。这些小 G 蛋白均有 GDP/GTP 结合及 GTP 酶活性,并在各种细胞和发育活动中作为双向转换器发挥作用,这些活动包括细胞周期进程、细胞存活、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞极性和运动以及囊泡和胞核转运 (1)。上游信号会刺激 GDP 结合形式(失活)解离 GDP,导致 GTP 结合及 GTP 结合形式(活化)的形成。活化 G 蛋白随后在其下游效应子结合区域发生构象变化,从而结合并调节下游效应子。固有 GTP 酶活性会阻断这种激活,使 GTP 水解成 GDP 并释放下游效应子。Ras 超家族蛋白的这些固有鸟嘌呤核苷酸交换和 GTP 水解活性还受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 的调控,GEF 会促进活化 GTP 结合形式和 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 的形成,从而将 GTP 酶还原成失活的 GDP 结合形式 (4)。

21 kDa 的鸟嘌呤-核苷酸结合蛋白(K-Ras、H-Ras 和 N-Ras)在活化(GTP 结合)和失活(GDP 结合)形式之间循环 (5)。受体酪氨酸激酶和 G 蛋白偶联受体会激活 Ras,从而刺激 Raf-MEK-MAPK 通路 (6-8)。GAP 蛋白通常会促进 Ras 失活。但在 30% 的人肿瘤细胞中,Ras 的点突变可防止该通路发生 GAP 介导性抑制 (9)。肿瘤细胞中最常见的致癌性 Ras 突变是 Gly12 突变为 Asp (G12D),这可能通过增加蛋白的整体刚性来防止 Ras 失活 (9,10)。

  1. Takai, Y. et al. (2001) Physiol Rev 81, 153-208.
  2. Colicelli, J. (2004) Sci STKE 2004, RE13.
  3. Wennerberg, K. et al. (2005) J Cell Sci 118, 843-6.
  4. Vigil, D. et al. (2010) Nat Rev Cancer 10, 842-57.
  5. Boguski, M.S. and McCormick, F. (1993) Nature 366, 643-54.
  6. Avruch, J. et al. (1994) Trends Biochem Sci 19, 279-83.
  7. Buday, L. and Downward, J. (1993) Cell 73, 611-20.
  8. Huang, D.C. et al. (1993) Mol Cell Biol 13, 2420-31.
  9. Bos, J.L. (1989) Cancer Res 49, 4682-9.
  10. Ma, J. and Karplus, M. (1997) J Mol Biol 274, 114-31.
Entrez-Gene Id
3265
Swiss-Prot Acc.
P01112
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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