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13593
Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol)
缓冲液与染料

Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593

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13593S
1 个试剂盒(100 次测试)

未包括的试剂

  1. 红细胞裂解缓冲液
  2. 非偶联或偶联一抗
  3. 荧光素偶联的二抗(如适用)
  4. 细胞染料(如死活细胞鉴定染料、DNA 染料等),可选

注:首次使用任何一抗或二抗时,对抗体进行滴定,以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

存储:

保存在建议温度下且不使用时,该试剂盒中的所有组分可保持稳定至少 12 个月。甲醛固定剂应在开封后一个月内使用。收到时,#13616 应保存在 4°C 下。剩余组分应保存在室温下。

实验步骤

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#13593 细胞内流式细胞仪(甲醇)

:使用该试剂盒前,请参阅产品网页了解目标抗体,以确定抗体是否在使用甲醇通透实验步骤的流式细胞术 (F) 实验中经过了验证。

:与荧光细胞染料(包括死活细胞鉴定染料、DNA 染料等)一同使用时,请参阅染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

A. 溶液和试剂

提供的试剂:

  1. 10X 洗涤缓冲液,磷酸缓冲盐 (PBS) (#12528):使用反渗透去离子 (RODI) 水或同等级别的水将所需的量稀释成 1X 工作溶液,然后混匀。保存在 4°C 下,一旦稀释,应在一个月内使用。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746):储存在室温下。启封后一个月内使用。
  3. 100% 甲醇 (#13604):可长期保存在室温下。使用前冷藏至 -20°C。
  4. 流式细胞仪抗体稀释缓冲液 (#13616):保存在 4°C 下。

其他试剂(未提供):

  1. Red blood cell lysis buffer (#46232)
  2. 非偶联或荧光染料偶联一抗
  3. 荧光素偶联的二抗(如适用)
  4. 细胞染料(如死活细胞鉴定染料、DNA 染料等),可选

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞缓慢添加冰冷的 100 % 甲醇至 90​% 甲醇的最终浓度,从而通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行免疫染色或在 -20°C 下将细胞保存 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的抗体或抗体接合物(按照建议的稀释度用流式细胞术抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。请参阅个别抗体数据表或产品网页,了解建议的稀释度,或通过滴定确定。
  4. 在室温 (20-25°C) 下孵育 1 小时。
  5. 用足够的 1X 洗涤缓冲液通过离心来洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 如果使用荧光素偶联的一抗,则在200-500 µl 1X PBS 洗涤缓冲液中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。对于非偶联的一抗,继续进行下一步骤。
  7. 在荧光素偶联的二抗(按照建议的稀释比例,用流式细胞术抗体稀释缓冲液 (13616#) 稀释)中重悬细胞。
  8. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。
  9. 用足够的 1X 洗涤缓冲液通过离心来洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  10. 在 200-500 µl 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2018 年 8 月 

修订于 2019 年 10 月

实验步骤编号:1728

产品说明

胞内流式细胞术试剂盒提供维持蛋白状态并使抗体能够结合胞内靶标所需的支持试剂,用于对悬浮液中的细胞进行流式细胞分析。遵循其中包含的实验步骤时,该试剂盒包含的试剂足以用于 100 份个别样品。

重要提示:请参阅抗体产品页,以确定抗体是否经验证可用于流式细胞术 (F),并了解有关相应抗体稀释度的信息。某些一抗可能需要去垢剂通透,这在说明书上会有说明。该试剂盒不包含去垢剂。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。

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