内参和标签抗体促销 | 点击此处 >>
8525
Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
偶联抗体

Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #8525

引用 (0)
筛选器:
  1. F

使用 Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 和 Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #3458 ,对经不同步处理的 Jurkat 细胞进行双色流式细胞分析。显示为绿色(门控)的细胞是有丝分裂细胞,并且磷酸-极光激酶和磷酸-组蛋白 H3 呈阳性,而显示为蓝色的细胞是非有丝分裂细胞。

购买 # 8525S
产品货号 规格 价格 库存
8525S
100 µl (50 次测试)

支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体与 Alexa Fluor® 488荧光染料偶联,并经内部测试用于人细胞的直接流式细胞和免疫荧光分析检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP® Rabbit mAb #2914 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
流式细胞术 1:50

存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

实验步骤

打印

查看 > 折叠 >

针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号:407

特异性/敏感性

仅当极光激酶 A/B/C 分别在 Thr288、Thr232 或 Thr198 位点被磷酸化时,Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) (D13A11) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 才可检测到内源水平的极光激酶 A/B/C 。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人 Aurora B 的 Thr232 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Aurora 激酶属于高度保守的有丝分裂丝氨酸/苏氨酸激酶家族,已在哺乳动物细胞中识别出该家族的三个成员,分别为 Aurora A、B 和 C (1,2)。研究表明,时序表达模式和 Aurora 激酶在有丝分裂亚细胞定位与有丝分裂结构有关。Aurora 激酶的功能可作用于 G2 期到胞质分裂,有可能涉及重要的细胞周期事件,如中心体复制、染色体双向定位和隔离、卵裂沟的定位和脱离 (3)。Aurora A 在中心体上被发现,沿着有丝分裂的纺锤体微管以及在有丝分裂增殖细胞的细胞浆中分布。Aurora A 蛋白水平在 G1 期和 S 期很低,在细胞周期 G2/M 期达到最高。Aurora A 在催化域 Thr288 位点的磷酸化会增加激酶活性。Aurora A 可参与中心体分离、成熟和纺锤体装配和稳定性。Aurora B 蛋白也在细胞周期 G2/M 期表达最多;Aurora B 激酶活性在有丝分裂的中期到末期时最高。前期时 Aurora B 在染色体定位到纺锤体之前与之结合。Aurora B 通过控制微管-着丝粒的结合和胞质分裂调控染色体分离。G2/M期 Aurora A 和 Aurora B 的表达与组蛋白 H3 的磷酸化高度一致 (4,5);研究人员已经发现多种人类癌症中这些激酶均呈过表达 (2,4)。在前期到胞质分裂期,Aurora C 都位于中心体上, mRNA 和蛋白水平都在 G2/M 期达到最高。尽管典型的 Aurora C 蛋白的表达局限在睾丸中,但研究发现多种癌细胞系中也有过表达的 Aurora C (6)。

  1. Warner, S.L. et al. (2003) Mol Cancer Ther 2, 589-95.
  2. Katayama, H. et al. (2003) Cancer Metastasis Rev 22, 451-64.
  3. Andrews, P.D. et al. (2003) Curr Opin Cell Biol 15, 672-83.
  4. Pascreau, G. et al. (2003) Prog Cell Cycle Res 5, 369-74.
  5. Crosio, C. et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3), 874-885.
  6. Kimura, M. et al. (1999) J Biol Chem 274, 7334-40.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
DRAQ5 是 Biostatus Limited 的注册商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售,仅供研究使用,不可与 DNA 微阵列结合使用。Alexa Fluor® 染料(除 Alexa Fluor® 430 染料外)是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。

Powered By OneLink