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13842
Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)
偶联抗体

Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) #13842

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk 内源性 兔 IgG
流式细胞术

使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) 对未经处理(蓝色)或已经小鼠血小板源性生长因子 BB(200 ng/ml,10 分钟;绿色)处理的血清饥饿 NIH/3T3 细胞进行流式细胞分析。

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针对需甲醇通透的直标抗体的实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛(无甲醇)
  3. 100% 甲醇
  4. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的直标抗体(按照建议的稀释度在孵育缓冲液中制备)中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色,那么继续进行可选的 DNA 染色(参见 E 部分)。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号:407

应用 稀释度
流式细胞术 1:50
存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。切勿分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

仅当 Akt1 蛋白在 Thr308 位点被磷酸化时,Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) 才能识别出内源水平的 Akt1 蛋白。该抗体在 Thr309 磷酸化后也可识别内源水平的 Akt2 蛋白,或者当 Thr305 磷酸化后可识别内源水平的 Akt3 蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

使用与人 Akt1 蛋白中 Thr308 周围残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合藻红蛋白 (PE),并可对小鼠细胞进行直接的流式细胞术分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb #13038 相同。

Akt也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14),并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16),参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是,Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)(在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子)(18,19)。

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Entrez-Gene Id
207 , 208 , 10000
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P31751 , Q9Y243
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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