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Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
偶联抗体

Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #5123

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk Dm 内源性 兔 IgG
流式细胞术

使用 Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 偶联) (实线) 或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 偶联) #2985 (虚线),对未处理(绿色)或经LY294002 #9901 (50uM, 2小时), Wortmannin #9951 (1uM, 2小时) 和 U0126 #9903 (10uM, 2小时) 处理的 jurkat 细胞进行流式细胞分析。

了解更多有关我们如何获得图像的信息。

针对需甲醇通透的直标抗体的实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛(无甲醇)
  3. 100% 甲醇
  4. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的直标抗体(按照建议的稀释度在孵育缓冲液中制备)中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色,那么继续进行可选的 DNA 染色(参见 E 部分)。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号:407

应用 稀释度
流式细胞术 1:50
存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

仅当 4E-BP1 在 Thr37 和/或 Thr46 位点被磷酸化时,Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 方可检测内源水平的 4E-BP1 。该抗体可能会与在相同位点被磷酸化的 4E-BP2 和 4E-BP3 发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴, 黑腹果蝇

使用与小鼠 4E-BP1 中 Thr37 和 Thr46 周围的残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。该抗体在最合适的条件下偶联 Alexa Fluor® 647,其中 F/P 比值为 2-5。

红光(如 633 nm 氦氖激光)可最大程度刺激 Alexa Fluor® 647 染料。Alexa Fluor® 647 染料的抗体接合物会产生明亮的远红外荧光发射,峰值为 665 nm。

Cell Signaling Technology (CST) 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 647荧光染料,并可对人细胞进行直接的流式细胞分析内部检测。非偶联的抗体 Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb #2855 会与人、小鼠、大鼠和猴的磷酸 4E-BP1 (Thr37/46) 发生反应。CST 预计 phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 还可识别这些物种中的磷酸 4E-BP1。

翻译抑制蛋白 4E-BP1(也称为 PHAS-1)可通过结合翻译起始因子 eIF4E 抑制帽子结构依赖性翻译。4E-BP1 的高度磷酸化会扰乱这种相互作用,进而导致帽子结构依赖性翻译被激活 (1)。PI3 激酶/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶均可调节 4E-BP1 活性 (2,3)。多个 4E-BP1 残基在体内被磷酸化 (4)。一般认为FRAP/mTOR 在 Thr37 和 Thr46 的磷酸化虽然不会阻碍 4E-BP1 与 eIF4E的结合,但会引导4E-BP1 后续在 Ser65 和 Thr70 的磷酸化 (5)。

  1. Pause, A. et al. (1994) Nature 371, 762-7.
  2. Brunn, G.J. et al. (1997) Science 277, 99-101.
  3. Gingras, A.C. et al. (1998) Genes Dev 12, 502-13.
  4. Fadden, P. et al. (1997) J Biol Chem 272, 10240-7.
  5. Gingras, A.C. et al. (1999) Genes Dev 13, 1422-37.
Entrez-Gene Id
1978
Swiss-Prot Acc.
Q13541
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售,仅供研究使用,不可与 DNA 微阵列结合使用。Alexa Fluor® 染料(除 Alexa Fluor® 430 染料外)是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。
第 7,429,487 号美国专利,外国对应物,以及由此而来的儿童专利。

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