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91551
FoxO1 (C29H4) Rabbit mAb (Pacific Blue™ Conjugate)
偶联抗体

FoxO1 (C29H4) Rabbit mAb (Pacific Blue™ Conjugate) #91551

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk 内源性 兔 IgG
流式细胞术

使用 FoxO1 (C29H4) 兔单克隆抗体 (Pacific Blue™ 偶联物)(实线)或浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 (Pacific Blue™ 偶联物) #9078(虚线)对 Jurkat 细胞(蓝色)和 IGROV-1 细胞(绿色)进行流式细胞分析。

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针对需甲醇通透的直标抗体的实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛(无甲醇)
  3. 100% 甲醇
  4. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的直标抗体(按照建议的稀释度在孵育缓冲液中制备)中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色,那么继续进行可选的 DNA 染色(参见 E 部分)。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号:407

应用 稀释度
流式细胞术 1:50
存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

FoxO1 (C29H4) 兔单克隆抗体 (Pacific Blue™ 偶联物) 可检测 FoxO1 内源水平的总蛋白。该抗体不能检测内源性表达家族成员 FoxO3a 或 FoxO4。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

使用与人 FoxO1 的羧基末端残基相对应的 GST - 融合蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体偶联 Pacific Blue™ 荧光染料,并在内部对人细胞进行了直接的流式细胞分析检测。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的抗体 FoxO1 (C29H4) 兔单克隆抗体 #2880 相同。

Forkhead 转录因子家族参与横纹肌肉瘤和急性白血病的发生 (1-3)。这个家族中,三个成员(FoxO1、FoxO4、 FoxO3a)与线虫的同源基因 DAF-16 具有序列相似度,而 DAF-16 信号转导包括 IGFR1,PI3K 和 Akt 在内的信号通路 (4-6)。活化的 forkhead 成员作为抑癌基因,促进细胞周期阻滞和凋亡。FoxO 家族任何成员的表达上调,均会激活细胞周期抑制剂 p27 Kip1。Forkhead 转录因子也参与 TGF-β 介导的 p21 Cip1 上调,而这个上调过程可以被 PI3K 负调控 (7)。Forkhead 转录因子通过 Akt 在 Thr24、Ser256 和 Ser319 位点的磷酸化灭活时,增殖增加,导致出核和转录因子活性受到抑制 (8)。Forkhead 转录因子还可被 deacetylase sirtuin (SirT1) 抑制 (9)。

  1. Anderson, M.J. et al. (1998) Genomics 47, 187-99.
  2. Galili, N. et al. (1993) Nat Genet 5, 230-5.
  3. Borkhardt, A. et al. (1997) Oncogene 14, 195-202.
  4. Nakae, J. et al. (1999) J Biol Chem 274, 15982-5.
  5. Rena, G. et al. (1999) J Biol Chem 274, 17179-83.
  6. Guo, S. et al. (1999) J Biol Chem 274, 17184-92.
  7. Seoane, J. et al. (2004) Cell 117, 211-23.
  8. Arden, K.C. (2004) Mol Cell 14, 416-8.
  9. Yang, Y. et al. (2005) EMBO J 24, 1021-32.
Entrez-Gene Id
2308
Swiss-Prot Acc.
Q12778
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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