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48947
BLNK (D3P2H) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)
偶联抗体

BLNK (D3P2H) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) #48947

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筛选器:
  1. F

使用 BLNK (D3P2H) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) 对用 CD19-FITC(左图)和 CD3-APC(右图)共染色的人全血细胞进行流式细胞分析。BLNK 在 CD19+ B 细胞中呈阳性,而在 CD3+ T 细胞中呈阴性。分析对象为淋巴细胞门中的细胞。

购买 # 48947S
产品货号 规格 价格 库存
48947S
100 µl (50 次测试)

支持数据

反应性 H M
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合藻红蛋白 (PE),并可对人体细胞进行了直接的流式细胞术分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 BLNK (D8P2H) XP® Rabbit mAb #36438 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
流式细胞术 1:50

存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

实验步骤

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针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号:407

特异性/敏感性

BLNK (D8P2H) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate) 可识别内源水平的 BLNK 总蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠

来源/纯化

使用与人 BLNK 蛋白 Arg282 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

B 细胞连接蛋白 (BLNK) 也称 SLP-65 或 BASH,是一个接头蛋白分子,在 B 细胞激活和 B 细胞抗原受体 (BCR) 结合中发挥重要作用。BLNK 在 BCR 相关的 Syk 和下游信号转导级联之间发挥作用 (1,2)。BLNK 在氨基末端有多个 SH2 结合基序 (YXXP),在羧基末端有一个 SH2 结构域。结合 BCR 后,BLNK 在多个 YXXP 基序上被 Syk 磷酸化,包括 Tyr72、Tyr84、Tyr96 和 Tyr178 (1)。这些磷酸化基序为信号转导分子(如 BTK、PLCγ 和 Vav)提供停泊位点。这些信号转导分子通过它们的 SH2 结构域结合 BLNK,并一同激活下游信号转导通路 (3,4)。通过其 SH2 结构域,BLNK 还能与酪氨酸磷酸化的靶标蛋白(如 HPK1)相互作用,从而募集到 BCR 复合体以进行信号转导 (5)。

  1. Kurosaki, T. and Tsukada, S. (2000) Immunity 12, 1-5.
  2. Fu, C. et al. (1998) Immunity 9, 93-103.
  3. Ishiai, M. et al. (1999) Immunity 10, 117-25.
  4. Baba, Y. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2582-86.
  5. Tsuji, S. et al. (2001) J. Exp. Med. 194, 529-539.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。

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