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10408
Bim (C34C5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
偶联抗体

Bim (C34C5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #10408

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筛选器:
  1. F

以浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体 IgG XP® 同型对照 (Alexa Fluor® 647 偶联物) #2985(虚线)作为对照,使用 Bim (C34C5) 兔单克隆抗体 (Alexa Fluor® 647 偶联物)(实线)对 Hela 细胞进行流式细胞分析。

购买 # 10408S
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10408S
100 µl (50 次测试)

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支持数据

反应性 H M R
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 647 荧光染料,并可对人体细胞进行直接的流式细胞分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 Bim (C34C5) Rabbit mAb #2933 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
流式细胞术 1:50

存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

实验步骤

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针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号:407

特异性/敏感性

Bim (C34C5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测内源水平的 Bim 总蛋白(EL、L 和 S 同工型)。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

猴, 牛 , 犬 , 猪

来源/纯化

使用与 Bim Pro25 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Bim/Bod 是一种促凋亡蛋白,属于 Bcl-2 家族中仅包含 BH3 的亚家族,该亚家族成员包括 Bad、Bid、Bik、Hrk 和 Noxa,都包含一个 BH3 结构域,但缺乏其他保守的 BH1 或 BH2 结构域 (1,2)。Bim 结合并拮抗 Bcl-2 家族的抗凋亡成员而诱导凋亡。研究观察到 Bim 与 Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1 和 BHRF-1 相互作用 (1,2)。Bim 可调节与胸腺细胞阴性选择和随后的生长因子退出有关的细胞凋亡,在生长因子退出过程中 Bim 表达升高 (3-6)。选择性剪切会产生三种主要的 Bim 同工型:BimEL、BimL 和 BimS (1)。BimS 是最短的同工型,细胞毒性最强,通常仅在细胞凋亡过程中瞬时表达。BimEL 和 BimL 同工型能通过与动力蛋白轻链相互作用被隔绝到动力蛋白运动复合体,并在细胞凋亡期间从这个复合体上释放 (7)。其余较长同工型的凋亡活性可能受到磷酸化调节 (8,9)。环境应激会引起 JNK 磷酸化 Bim,使 Bim 与动力蛋白复合体解离并增加凋亡活性。

  1. O'Connor, L. et al. (1998) EMBO J 17, 384-95.
  2. Hsu, S.Y. et al. (1998) Mol Endocrinol 12, 1432-40.
  3. Bouillet, P. et al. (2002) Nature 415, 922-6.
  4. Whitfield, J. et al. (2001) Neuron 29, 629-43.
  5. Dijkers, P.F. et al. (2000) Curr Biol 10, 1201-4.
  6. Ley, R. et al. (2003) J Biol Chem 278, 18811-6.
  7. Puthalakath, H. et al. (1999) Mol Cell 3, 287-96.
  8. Lei, K. and Davis, R.J. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2432-7.
  9. Putcha, G.V. et al. (2003) Neuron 38, 899-914.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
Alexa Fluor 是 Life Technologies 公司的注册商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料接合物已获得 Life Technologies Corporation 的许可销售,仅供研究使用,不可与 DNA 微阵列和高内涵筛选 (HCS) 合并使用。
提供的本品取得了 Life Technologies Corporation 的知识产权许可。本产品的转让条件为买方仅可将购买的产品用于由买方开展的研究,不包括合同研究或任何收取费用的服务研究,买方不得 (1) 将本产品或其组分用于以下目的:(a) 用于诊断、诊疗或预防的目的;(b) 用于检测、分析或筛选服务或获得信息,以按检测收取报酬;或 (c) 用于制造或质量保证或质量控制,和/或 (2) 销售或转让本产品或其组分用于转售,无论是否转售供研究使用。如需了解有关购买本品用于除上述目的之外目的的许可信息,请联系 Life Technologies Corporation(地址:5791Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008 USA)或 outlicensing@lifetech.com。

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