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8584
β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
偶联抗体

β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #8584

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筛选器:
  1. IF
  2. F

使用 β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(蓝色假色)对 COS-7 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。红色 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。

以浓度匹配的兔 (DA1E) 单克隆抗体IgG XP® 同型对照 (Alexa Fluor® 647 偶联物) #2985(虚线)作为对照,使用 β-肌动蛋白 (13E5) 兔单克隆抗体 (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(实线)对 Hela 细胞进行流式细胞分析。

购买 # 8584S
产品货号 规格 价格 库存
8584S
100 µl (50 次测试)

支持数据

反应性 H M R Mk B Pg
敏感性 内源性
MW (kDa)
同型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 647荧光染料,并可分别对人和猴细胞进行直接的流式细胞术和免疫荧光分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:50
流式细胞术 1:50

存储:

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100):要配制 10 ml:添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中,混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  8. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2010 年 12 月

实验步骤编号:220

针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

:固定前,应分离黏附细胞或组织,并放在单细胞悬浮液中。

注意:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者,细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号:407

特异性/敏感性

β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测内源水平的总 β-肌动蛋白。该抗体可与 γ-肌动蛋白(细胞质同工型)发生交叉反应。它不与 α-骨骼肌、α-心肌、α-血管平滑肌或 γ-肠道平滑肌同工型发生交叉反应。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴, 牛 , 猪

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

仓鼠 , 鸡 , 犬 , 马

来源/纯化

使用与人 β-肌动蛋白氨基末端周围的残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

作为一种普遍表达的真核蛋白,肌动蛋白是细胞骨架的一种主要组分。哺乳动物至少有 6 种已知的同工型。非肌肉 β- 和 γ- 肌动蛋白也称为细胞质肌动蛋白,主要在非肌肉细胞中表达,可控制细胞结构和运动 (1)。α-心肌和 α-骨骼肌肌动蛋白分别在心脏横纹肌和骨骼肌中表达;两种平滑肌肌动蛋白(α- 和 γ-肌动蛋白)主要见于血管平滑肌和肠道平滑肌。这些肌蛋白同工型可调节肌肉细胞收缩能力 (1)。肌动蛋白主要作为一种纤维聚合物纤丝状肌动蛋白而存在。在一些进程(如胞质分裂、内吞或应激)中,在细胞骨架重组信号的刺激下,丝切蛋白促进纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚合导致单体球状形式球型肌动蛋白的增加 (2)。Arp2/3 复合体可稳定纤丝状肌动蛋白片段,并促进新肌动蛋白丝的形成 (2)。研究表明,肌动蛋白在原发性乳腺癌中被过度磷酸化 (3)。研究也表明,已经在体外、心肌和骨骼肌中观察到凋亡条件下的肌动蛋白的剪切 (4-6)。被 caspase-3 剪切的肌动蛋白,会加速泛素/蛋白酶体依赖的肌肉蛋白水解 (6)。

  1. Herman, I.M. (1993) Curr Opin Cell Biol 5, 48-55.
  2. Condeelis, J. (2001) Trends Cell Biol 11, 288-93.
  3. Lim, Y.P. et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10, 3980-7.
  4. Kayalar, C. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 2234-8.
  5. Communal, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 6252-6.
  6. Du, J. et al. (2004) J. Clin. Invest. 113, 115-23.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售,仅供研究使用,不可与 DNA 微阵列结合使用。Alexa Fluor® 染料(除 Alexa Fluor® 430 染料外)是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。

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